奶牛乳房炎是奶牛饲养中的常见疾病，该病病因复杂，且发病率较高，对奶牛产业产生巨大的影响[1]。该病主要是由微生物引起的，或因理化刺激导致的乳腺炎症，其中大肠杆菌、链球菌及葡萄球菌等都是造成该病的病原菌[2]，本研究主要探究抗菌肽NZ2114 对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌细胞膜、基因组和耐药性的影响，以期为临床治疗药物研制开发工作提供有效的数据、理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

主要试剂：纯化抗菌肽NZ2114（由锦州医科大学生命科学院纯化保存），培养基、细菌基因提取的试剂盒、聚合酶、碘化丙啶等购自大连宝生物试剂有限公司。

相关仪器：全温振荡培养箱（银川市金属制品厂）、冷冻离心机（Sigma）、酶标分析仪（Thermo Fisher）、超净工作台(海尔)、流式细胞仪（Thermo Fisher）等。

1.2 方法

1.2.1 病菌的分离鉴定

从患病奶牛体内提取样本，首先用75%的酒精对奶牛乳头实施消毒处理，待牛乳头自然风干后取奶样，弃去前3 把奶，从第4 次奶样本开始采集，每次吸取20mL 样品置于无菌管内，4℃储存备用，在18h 内进行后续试验。把样品接种到培养基内，37℃下培养12～18h，挑取单菌落进行革兰氏染色，全面观察相应菌落的形态变化，提取细菌基因组，进行基因鉴定。随后将确定后的葡萄球菌放置在30%的甘油MH 液体培养基内-20℃储存。

1.2.2 杀菌活性检测

在抗菌肽NZ2114 作用下，对葡萄球菌活性进行最小抑菌浓 度值（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）测定。将菌体接种到平板培养基内，250r/min 振荡，37℃环境下培养过夜，跳取单菌落，将其转移到MH 液体培养基中，活化至对数生长期。将得到的病菌充分震荡制作为菌悬液，在96孔培养板中进行无菌培养。用磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）将抗菌肽NZ2114 进行两倍稀释，以每孔10μL 的标准接种至96 孔细胞培养板中，并设PBS 阴性对照组，MH 培养基为空白对照组。实施3 个平行样板的处理，把培养板放到37℃孵化培育16～18h，直到阴性对照孔中产生较为明显的浑浊细菌液体，可对细菌成长形成有效抑制作用的浓度便是抗菌肽NZ2114 MIC 值。

1.2.3 细胞膜完整性试验

采用流式细胞术分析测定细胞膜的完整性。将过夜培养处在对数生长期的葡萄球菌液进行细胞处理计数后，用含2%牛血清白蛋白的PBS 重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL，吸取100uL 制备待测样品，终浓度为1×106/mL。待测样品中加入抗菌肽NZ2114，得到4×MIC、2×MIC、1×MIC、1/4×MIC 的待测样品，并设置空白对照和阴性对照，充分混匀37℃培养0.5h 后离心，弃去上清液，用PBS 冲洗两遍。再用上机检测前加入碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染液，直至液体浓度为50μg/mL，再放置室温下孵化15min，然后利用流式细胞仪全面记录PI 着染的阳性细菌细胞数量[3]。

1.2.4 耐药性检测

扫描电镜观察中，把葡萄球菌培养到对数生长期限为止，通过PBS 进行稀释，形成菌悬液。随后将抗菌肽NZ2114 添加到菌悬液内，对其浓度进行合理调整。将没有添加抗菌肽NZ2114 的PBS 当成阴性对照组，37℃静置培养2h，4000r/min 离心5min，使用PBS 对细菌进行两次清洗。在菌体沉淀中加入戊二醛缓冲液，进行轻吹混匀，悬浮完成后，于4℃冰箱固定过夜。之后进行漂洗并用乙醇梯度脱水，每次15min。然后样本用临界点干燥仪进行干燥处理。并在样品外表镀上一层金属膜，再用电子显微镜进行扫描。在葡萄球菌实施耐药基因检测中，需要把病菌体放置于对数生长期内，随后将其制成菌液模式，将抗菌肽NZ2114 添加到菌液中，调配到合理浓度，提取抗菌肽NZ2114 处理前后细菌基因样本，并针对多黏菌素、杆菌肽类及内酰胺类等药物实施耐药基因检测。

2 结果与分析

2.1 细菌胞膜的完整性

抗菌肽NZ2114 的抑菌活性分析相关测定结果如下（图1），抗菌肽NZ2114 在葡萄球菌中的从S1 到S10MIC 主要是0.5、1、1、1、0.5、1、0.5、1μg/mL。将拥有广泛耐药谱的S7 葡萄球菌当成代表菌种开展完整细菌胞膜分析。研究结果表明，未被抗菌肽NZ2114 有效处理过的病菌体，基本上未观察到PI 感染情况，可以证实病原菌保留了完整的细胞膜。被处理过的病菌体，有5%的PI 穿膜率，因此得出葡萄球菌细胞膜可被抗菌肽NZ2114 损坏，但没有太大的依赖性[4]。

图1 流式细胞仪葡萄球菌细胞分析结果

抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌拥有较强的抑菌活性。碘化丙啶属于核酸染料，会与细胞中的RNA 及DNA 产生特异性结合，在细胞膜有完整结构的条件下，碘化丙啶无法进入细胞内，但在细胞膜遭受破坏后可以顺利进入，并与细胞中的核酸进行有机融合，通过流式细胞仪能检测到一种红色荧光，计算染色细菌比例。碘化丙啶在细胞中的数量越大，所产生的荧光强度越强，为此可以根据荧光的强弱程度对细胞膜破坏程度进行判断。

2.2 抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌外在形态的影响

由图2 可知，仔细观察电镜下抗菌肽NZ2114 处理过程。未经抗菌肽NZ2114 作用的细胞表层形态未发生改变，电镜下显示为饱满的病菌细胞，并且各细胞比较分散，且细胞表面光滑。被抗菌肽NZ2114 处理的病菌细胞的胞内物质会露出且细胞体积缩小。随着不断加入抗菌肽，病菌细胞受损程度随着抗菌肽NZ2114 浓度的增高而加大。

图2 抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌形态影响

2.3 抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌耐药性影响

抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌处理前后耐药率结果如表1所示。在葡萄球菌药敏试验中，经过抗菌肽NZ2114 处理后相关病菌体对某种抗生素敏感性有所提高。进一步检测其耐药基因可以发现，抗菌肽NZ2114会对葡萄球菌内部基因组携带耐药基因产生影响。某些耐药基因在处理后无法检测，拥有稳定的遗传特性。

表1 抗菌肽NZ2114 对葡萄球菌处理前后的耐药率 单位：%

注：N(X/Y)，N 为耐药率，X 为耐药株数量，Y 为受试菌株数

通过分析能够发现在应用抗菌肽NZ2114 前，90%～100%未经处理的葡萄球菌对磺胺异恶唑与杆菌肽有耐药性、50%～60%对含有内酰胺的抗生素有耐药性、40%对粘菌素耐药性、50%对诺氟沙星有耐药性、30%对克林霉素有耐药性、10%对链霉素有耐药性。另外一部分葡萄球菌存在多重耐药，同时对青霉素、磺胺异恶唑及杆菌肽等耐药。但目前还没有找到对环丙沙星耐药的菌株。葡萄球菌被抗菌肽 NZ2114 处理后，其对内酰胺抗生青霉素、氨苄西林等耐药率降低了30%、10%，对多黏菌素B 的耐药率下降几乎达到了40%，对阿莫西林、磺胺异恶唑等药物的耐药率没有明显改变，对其余抗生素的耐药率都显著下降。

3 结论

试验结果表明葡萄球菌细胞膜可被抗菌肽NZ2114 损坏，在电镜下细胞膜随着抗菌肽作用时间越长损伤越大，同时经抗菌肽NZ2114 作用后耐药性明显降低。证明抗菌肽NZ2114针对金黄色葡萄球菌有一定的抑制杀菌效果。