摘要：奶牛布病是重要的人畜共患病之一。国家从实施稳控到提出净化，对此给予了高度重视。在基层诊断和实施净化过程中,检测起着关键作用。临床检测中，常存在免疫后的奶牛出现临床症状，存在布病免疫抗体还是感染抗体不易区分的现象，给基层诊断和净化工作带来了困难。本文主要介绍了奶牛布病免疫抗体与自然感染抗体鉴别诊断现状，并结合临床实践筛选出虎红平板凝集试验、试管凝集试验、竞争ELISA试验、琼扩试验、荧光偏振试验等四种不同组合鉴别方法，仅供参考。

关键词：布病；试管凝集；诊断；检测试剂；奶牛　

1 布病检测及鉴别诊断现状

布病的常规血清学诊断方法以光滑型脂多糖(S-LPS)抗原为基础，包括虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验(CFT)等。除S-LPS分子外，光滑型布鲁氏菌表面还有一种天然半抗原(native hapten，NH)。有研究表明，接种疫苗的动物血清中检测不到NH抗体的存在，而野毒感染血清中能够检测到NH抗体的存在。目前，市场上有布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）检测试剂盒，它是利用光滑型布鲁氏菌表面的一种天然半抗原来鉴定布病疫苗免疫和野毒感染的方法。另外，荧光偏振试验（FPA）作为新兴的布鲁氏a菌病检测方法，世界动物卫生组织（WOAH）在2016年批准了 FPA法用于牛布病的验证诊断以及羊和猪布病的检测。在我国，荧光偏振试验（FPA）也在现行的《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020年）》中被列为动物布病的初筛试验。与前述的传统血清学诊断方法相比，荧光偏振试验（FPA）操作简便，能够快速给出结果，在实验室和仪器之间具有高度的可重复性。此外，传统血清学检测方法的抗原大多是布鲁氏菌细胞膜上的光滑脂多糖（S-LPS），而FPA的抗原分子使用的是光滑脂多糖（S-LPS）中最具有免疫原性优势的O-多糖（OPS），这使得FPA法能够区分免疫动物和自然感染动物，疫苗免疫后动物体内OPS抗体水平非常低，而自然感染动物体内抗体水平高。有报道显示，FPA的敏感性和特异性均很高，能达到90.02%和99.96%。鉴于上述报道，笔者结合实际工作，对奶牛布病自然感染抗体和疫苗免疫抗体鉴别诊断进行了探索，总结出以下四种方案。

2 鉴别诊断方案的确立试验

2.1 鉴别诊断筛选方案（一）

1）试验对象 采集未免疫布病或免疫期超过18个月的奶牛血清12,567份。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作。

3）试验结果 虎红平板凝集试验初筛79份阳性，试管凝集试验或竞争ELISA试验复核出阳性20份，结果见表1。

4）结论与分析 由结果可见虎红平板凝集试验的假阳性率还是很高的。未免疫机体或免疫超过18个月（疫苗抗体已经降低到检测程度以下），通过虎红平板凝集试验初筛，试管凝集试验或竞争ELISA试验复核阳性者可视为野毒感染牛。

2.2 鉴别诊断筛选方案（二） 

1）试验对象 采集免疫18个月内的无症状牛群血清5,179份。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作；④布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）试验参照试剂盒（青岛瑞尔唯特生物技术有限公司）说明书操作。操作步骤：将15μL阳性对照和15μL阴性对照加入琼脂板侧面的2个孔中。在琼脂板侧面剩下的孔中加入15μL待测血清。将15μL抗原加入到中央孔中。将接种好的琼脂板在培养箱中室温孵育24～48h；结果读取及解释：在24h和48h后读取结果，使用斜射光源。没有沉淀线意味着动物没有被感染。

3）试验结果 在试验奶牛场采集免疫18个月内奶牛血样5,179份，进行虎红平板凝集试验筛选，阳性数3,211份，阳性率62%（见表2）。抽检阳性血样392份进行布病抗体竞争ELISA试验，阳性数321份，符合率81.88%（见表3）。选择布病竞争ELISA试验阳性的血清150份（无症状牛）进行布病琼脂扩散试验，结果显示抗体均为阴性（见表4）。

4）结论与分析 免疫18个月内无临床症状牛群，虎红平板凝集试验，竞争ELISA试验为阳性均不能区分是免疫抗体还是野毒抗体。通过琼脂扩散试验复核，虎红平板凝集试验阳性样本，琼扩均为阴性，且临床健康，可视为抗体为疫苗抗体。

2.3 鉴别诊断筛选方案（三）

1）试验对象 采集免疫接种18个月内，个别出现临床症状的奶牛群血样279份。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作；④布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）试验参照2.2之2）中方法操作。

3）试验结果 采用虎红平板凝集试验筛选出181份阳性牛血，再采用试管凝集试验复核阳性150份（1:100血清稀释管内出现“++”以上凝集现象），将检测阳性的血样进行布病琼脂扩散试验，阳性17份，具体见表5。

4）结论与分析 免疫接种18个月内个别出现临床症状的奶牛群，虎红平板凝集阳性和试管凝集阳性不能判定免疫抗体还是野毒抗体，琼脂扩散复核后阳性，且有临床症状的个体视为野毒感染。即免疫期在18个月内的非健康奶牛群，结合流行病学调查，临床症状，进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验以及布病琼脂扩散试验区分自然感染抗体与免疫抗体鉴别诊断，琼扩复核阳性个体视为野毒感染牛。

2.4 鉴别诊断筛选方案（四）

1）试验对象 免疫情况不明，曾出现个别流产现象牛群，且虎红平板凝集试验、试管凝集试验均为阳性的25份样品。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作；④布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）试验参照2.2之2）操作；⑤荧光偏振试验参照试剂盒说明书操作。试验步骤：移取20μL阴阳对照和样品到玻璃管/深孔条的所有管或孔中。将阴性对照一式三份、一份阳性对照和待检样品分别加入玻璃管/深孔条的所有管或孔中。移取1mL样品稀释剂到10×75mm玻璃管中。仔细混合；室温下孵育2～5min。获取所有样品和对照的空白读数。在含有对照和样品的所有管中加入10μL示踪剂，仔细混合。在室温下孵育2～5min。获得所有样品和对照的mP读数；结果判定：ΔmP≤10判为阴性，ΔmP介于10～20判为可疑，ΔmP＞20判为阳性（ΔmP=样品mP值-阴性对照平均mP值)。阳性和可疑样品必须重新检测两次，如果两次重检的结果都是ΔmP≤10，则判定为阴性，如果两次重检中有任何一次结果ΔmP＞10，则判定为阳性。疫苗免疫区或部分高风险区，由于环境和流行病学的存在，建议采用如下截断值：ΔmP≤40判为阴性。ΔmP介于40～60判为可疑，ΔmP＞60判为阳性。

3）试验结果 对虎红平板凝集试验、试管凝集试验均为阳性的25份样品进行鉴别试验，结果见表6。

对照临床症状，对比几种试验得出：①琼脂扩散试验除1份外均为阳性；②竞争ELISA试验与试管凝集符合率80%，出现临床症状的样品竞争ELISA均为阳性；③琼脂扩散试验与临床症状符合率96%；④荧光偏振试验与临床症状阳性符合率100%。样品mP的值在150～180之间，阳性率达到98%，荧光偏振总体符合率60%，荧光偏振试验受免疫影响出现非感染性阳性的现象。

4）结论与分析 有临床症状，且琼扩阳性或者荧光偏振阳性的可视为野毒感染。虽然NH-GD试验也有敏感性低等不足，这与布鲁氏菌产生的抗原刺激强弱有关，因此没有出现NH沉淀带不一定是布病阴性动物；但其特异性非常高，没有一种实验方法能够达到100%的敏感性和特异性，因此可用敏感性高的RBT进行初筛实验，再用特异性高的NH-GD试验进行确诊。此外，荧光偏振试验（FPA）在有经济能力的场可用于布鲁氏菌病的鉴别诊断。牛场在免疫背景不明的情况下，可使用布病平板凝集试验和试管凝集试验（竞争ELISA试验）筛选，结合布病琼脂扩散试验的方法、荧光偏振试验、流行病学调查和临床症状进行综合鉴别诊断，阳性个体可视为野毒感染牛。

3小结

奶牛布病是影响较大的人畜共患病，同时严重威胁着公共卫生安全，为此国家提出了净化措施。作为基层工作者，为有效推进国家政策的实施，同时避免养殖场户的损失，探索简便实用的鉴别诊断技术具有重要意义。今后我们将继续在实际工作中积累发现好的技术方法，以有效推广应用。

参考文献：略

作者：许亚改，张超/石家庄市兽用生物制品供应站；沈东，陈二红，王泽宇/石家庄市农业综合行政执法支队

来源：《中国动物保健》2023年01月刊