液相阻断ELISA 实验原理是抗原抗体在液相中反应，病毒抗原与稀释好的被检血清首先在液相中反应，然后抗原抗体复合物和没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被转移到包被了口蹄疫特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，再通过酶结合物与底物显色10～15 min，最后加入终止液进行读数。抗体滴度以阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。

1、样品的保存及使用

全血样品采集后应尽快分离血清避免溶血，500～4000 rpm 离心 5～10 min；若无离心条件，可将全血样品在室温下(20℃)倾斜放置2~4小时(依室温而定)，或4~8 ℃环境中过夜待其自然凝固，然后转移上清液于新管待测。血清 0～4 ℃条件下可保存5 d，如采用 －15～－20℃ 冷冻保存时间更长。冷冻保存血清样品需在4～8 ℃条件下解冻，再平衡至室温，稀释前需充分混匀。

2、试剂的回温及孵育

（1）试剂回温

试剂盒中的试剂，包括包被用的反应板，在使用前应恢复至室温，将其提前拿出放置1～2 h平衡至室温（20～25℃），冬季可置于 25℃左右的恒温培养箱内回温。

（2）加样孵育

每次加样后反应板必须用封板膜封严，否则会造成水分过多蒸发，影响实验结果；反应板尽量均匀放置于孵育箱，不可重叠放置，以免传热不均匀。在孵育时，实验操作者一般习惯将ELISA板放入温箱即开始计时，没有考虑ELISA板孔内温度升至37℃尚需一定的时间，这样容易造成实际测定中温育时间不够，因此实验时需根据具体室温情况可适当增加ELISA板在温箱中的孵育时间。

3、不同批次试剂盒的使用

不同批次试剂盒中的每种试剂成分都被优化和作为一个整体工作，为了使实验结果准确，避免使用不同批次的试剂成分，尤其是病毒抗原，不同批病毒抗原的工作浓度不同，因此不能随意乱用，要对应于相同批次试剂盒中的各种成分使用，同时要避免反复冻融病毒抗原，可将其先进行小体积封装-20 ℃保存（-40 ℃保存效果更好），每次实验时按需取封装抗原。

4、试剂的配制

配制试剂前后都要充分混匀，浓缩的PBST液在低温下会有无机盐结晶析出，使用前可水浴或恒温培养箱融化，用无离子水或超纯水做25 倍稀释。底物溶液按操作说明配制，现配现用。

5、血清的稀释、加样、转移、洗涤及拍板

（1）血清的稀释：稀释待检血清时先加稀释液，然后加待检样品。

（2）加样：加样时要将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，同时轻轻晃动均匀，不能出现气泡，否则一些弱阳性的样品容易出现假阴性；加样不宜太快，不可溅出；每次加样都要保持同样的顺序，板数多者要单独计时，保证每板反应时间充足。

（3）移板：将抗原抗体混合液从反应板转移至ELISA板上，目的是将反应板中的抗原抗体复合物和没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原转移到包被了口蹄疫O型或A型特异性抗体的ELISA板中，继续进行后续的免疫反应及酶促反应。转移时，按顺序转移，避免出错，同时及时更换枪头。

（4）洗涤：洗涤是 ELISA 操作中的关键技术之一，每孔加入洗涤液300ul，洗涤 3~ 5次，同时每次洗涤的时间一般为 30 s。洗板时需保证酶标板平放，将洗涤液注满各孔，避免漏液、溢液现象。 

（5）拍板：拍板时避免手指接触板底，同时应注意观察板孔内有无气泡附着， 如有气泡，则需在加样前一一去除。

6、试验显色、终止、读数

（1）显色：显色是 ELISA 操作中的最后一个反应步骤，是酶催化无色底物，生成有色产物的过程。反应温度和时间是影响显色的因素。因此，加入底物后的反应温度应严格按实验操作说明书执行。根据底物显色情况，反应时间可适当调整为10～15 min。

（2）试验终止：终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应结束后应尽快加入终止液。

（3）OD 值读数：读数前应先将酶标仪预热半小时，读数时应注意微孔板底部洁净无污染，如有水分应仔细擦干，同时定期清洗酶标仪滤光片。

目前除了液相阻断ELISA试剂盒外，市场在售口蹄疫抗体检测试剂盒种类较多，其他大部分试剂盒仅包被结构蛋白VP1的部分片段；若仅包被VP1，导致毒株特异性强，而同一血清型不同谱系毒株VP1序列差异大，所以检测结果常常出现偏颇。而液相阻断ELISA抗体检测试剂盒包被全病毒抗原，对同一血清型不同谱系毒株差异小，检测结果更客观、准确。               

口蹄疫灭活疫苗属于生物制品，当疫苗注入机体后会发生复杂的反应，所以口蹄疫疫苗质量评价必须要科学全面，才能综合判断疫苗的免疫效力。抗体检测是目前评价口蹄疫疫苗免疫效果的重要方法之一。因此，首先要选择科学的检测方法和性质优良的试剂盒来评价免疫抗体水平；实验时，要仔细阅读说明书，严格按实验步骤操作；同时要对每个环节进行优化，提高实验结果的精确性，保证实验结果的真实性和客观性。               

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