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【口蹄疫】诊断技术

日期:2020-06-18 12:48:58

实验室诊断应选择上皮组织,最好是未破裂或刚破裂的水疱皮,至少应采集1g。为了避免对采样人员的伤害和动物福利,建议在采集任何样品之前,必须对动物施行镇静措施。

上皮样品应放在由等量甘油、pH.7.2~7.6的0.04 mol/L的磷酸缓冲液(PB)中,最好加抗生素[青霉素1000(IU),硫酸新霉素100(IU),多黏菌素B50(IU),制霉菌素100(IU)]组成的运输培养基中,如果没有0.04 mol/LPB,可以用组织培养液或磷酸盐缓冲液(PBS)代替,但甘油-缓冲液混合物的pH应在7.2~7.6范围内。样品应冷冻或冻结送至实验室。

对不能采集上皮组织的反刍动物,如感染前期或康复期的病例,或无临床症状的疑似病例可用食道探杯(猪用喉拭子)采集食道-咽(OP)液样品,送实验室进行病毒分离或RT-PCR。病毒血症也可以用RT-PCR或病毒分离的方法检测血清样品。对于猪的喉拭子采样,应将动物背部绑定在木桩上,伸直颈部,用合适的工具(如止血钳)夹持拭子,推向口腔上颚直到咽喉。

在采集牛或大反刍兽(如水牛)的OP液样品之前,将2mL运输液[含有0.01%牛血清蛋白、0.002%酚红和抗生素(青霉素1000单位/mL,制霉菌素100单位/mL,硫酸新霉素100单位/mL,多黏菌素50单位/mL),pH7.2的0.08 mol/L的缓冲液]加入到可耐受干冰或液氮、体积约5mL的抗冻容器内。

采集OP液样品时,通过舌面部插入一个探杯进入口咽部,然后在食道的第一部分和咽喉的背部间来回用力抽动5~10次。目的是收集口咽部液体,特别是来自于这些部位的表面上皮细胞,包括食道近端部分、咽壁、扁桃体隐窝和软腭表面。如果样品中不含有充分的细胞碎片,就要重新进行采样。

用食道探杯采集OP液后,将内容物倒入约20mL容量的广口瓶中,检查黏液的质量,应含有可见的细胞性物质。取2mL样品加2mL运输液,轻轻振摇混合,并使其最终pH为7.6左右。被反刍内容物污染的样品,不适于培养,必须弃去。肉眼可见混有血液的样品也不完全符合要求。此时,用清水或PBS冲洗动物口腔后,再重新采样。对一群动物采样,采集每头动物的探杯必须清洗干净并消毒,然后再采下一头动物。

采集小反刍兽OP液样品时,先将2mL运输液加到约20mL容量的广口瓶内,采集后,冲洗探杯,将OP液样品吸到运输液中,然后再将其转移到5mL的容器内进行运送。这种容器应能承受干冰或液氮的低温。

OP液样品采集后应立即冷藏或冻结,如果样品还需几小时运送,应将其放在干冰上或液氮中冷冻。冷冻前,应用密封式螺丝帽或硅胶仔细封口。当使用干冰时,这一点特别重要,因为二氧化碳进入OP液样品,将使pH降低,可能灭活样品中的病毒。一般不应使用玻璃容器,因为液氮渗漏进去或冻融时有产生爆炸的危险。OP液样品应在冰冻状态下送到实验室。

在国内或国际间运送易腐败的疑似口蹄疫病料时,需要采取特别的预防措施。国际空运联合会(IATA)危险品规则(DGR)对通过商业运输诊断样本的包装和运输有明确的要求。对于送样单和指导以及探杯使用的说明可以在Pirbright OIE参考实验室的网址(http://www.wrlfmd.org/)上找到。水疱病诊断和鉴别诊断的田间样品的采集和运输程序可以在泛美口蹄疫OIE参考实验的网站(http://www.panaftosa.org.br)上找到。

一、病原鉴定

一些样品,包括上皮组织、OP液样品和血清可能通过病毒分离或RT-PCR检测。相比之下,ELISA、CF和金标试纸条适用于检测上皮细胞悬液、水疱液和细胞培养上清,但是对于OP液样品或血清的直接检测还不够敏感。

1、病毒分离

从PBS/甘油中取出上皮样品,用吸水纸吸去甘油,以减少对细胞的毒性。样品称重,置于无菌研钵中,加入少量灭菌沙、组织培养液和抗生素,用无菌研槌研磨,再加入组织培养液,使最终为10%组织悬液。以2000g离心10分钟,澄清。将怀疑含有口蹄疫病毒样品接种细胞培养物中或未断奶乳鼠。敏感的细胞培养系统包括原代牛甲状腺细胞和初代的猪、犊牛和羔羊肾细胞。已建立的细胞系如幼仓鼠肾(BHK-21)和IB-RS-2细胞也可以使用,但其敏感性要比原代细胞低(对检测病毒含量低的样品)。任何细胞的敏感性应事先用标准毒株测定,常用IB-RS-2细胞分离猪源毒株是必要的,如O型CATHAY,SVDV只在猪源的细胞生长,可辅助鉴别猪水疱病(SVD)。细胞培养分离时,48小时应检查致细胞病变效应(CPE)。如果没有CPE出现,细胞培养物应冻融,再接种新鲜细胞培养物,并在48小时内检查CPE。也可用未断奶乳鼠代替细胞培养,但必须是2~7天的纯系小鼠。某些野毒在适应小鼠前需要连传数代。至于OP液,用同样体积的氯氟烃(CFCS)预处理,可以从免疫复合物中释放病毒以提高病毒检出率。

2、免疫学方法

(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)

检测口蹄疫病毒抗原和病毒血清型的优选方法是ELISA方法。这是一种间接夹心法试验,即在多孔板的不同排,用兔抗口蹄疫病毒7个血清型的抗血清包被,这些抗血清称为“捕获”血清。尔后,每排的各孔加入被检样品悬液,并设适当的对照。接着,再加每一个血清型口蹄疫病毒的豚鼠抗血清,随后,加酶标记的兔抗豚鼠血清。每一步都应充分洗涤,以去掉未结合的试剂。加酶底物后,出现颜色反应时可判为阳性反应。强阳性反应,肉眼即可判定,也可用分光光度计在适当的波长内读取结果。在这种情况下,光吸收值比背景大0.1以上即可判为阳性反应,可鉴定口蹄疫病毒的血清型;当光吸收值接近0.1时,应重做,或用组织培养物传代增殖抗原;当出现细胞病变效应(CPE)时,检测上清液。其他提供的检测程序在格式和解释标准稍有不同。

(2)补体结合试验

ELISA方法优于补体结合(CF)试验,因为它更特异、更敏感,并且不受前补体和抗补体因子的影响,但是,如果得不到ELISA试剂,可作CF试验。

3、核酸识别方法

RT-PCR可用于扩增诊断材料中口蹄疫病毒的基因组片段,包括上皮组织、奶、血清和OP液样品。Real-timeRT-PCR与病毒分离相比更敏感,并且自动化的程序增加了样品检出率。鉴定血清型的PCR定型的引物已确定。

荧光定量RT-PCR实验可以用同样的程序,即从测试或对照的样品中提取总RNA,紧接着用提取的RNA反转录。从样品中自动提取总RNA,然后通过自动移液程序进行RT和PCR步骤,这些可以替代上述的手工操作。RT产物的PCR扩增通过不同的程序执行。也可使用RT和PCR相结合一步法。实时扩增后,并不需要琼脂糖凝胶中检测PCR产物。

二、血清学试验

口蹄疫的血清学检测主要有以下四个目的,即:1)进出口前动物检验;2)确诊口蹄疫可疑病例;3)证实没有被感染;4)证明疫苗效力。根据上述提到的目的,为了区分免疫和感染,需根据动物群体是否免疫和是否已经使用了疫苗是否已实施紧急措施或启动后续免疫程序选择方法。当适当选择不同的检测方法和检测结果的不同解释时,必须依据目的考虑选择程序的有效性。例如,检测界限应根据畜群血清学监测设计临界值,而不是为了国际贸易的目的对单个动物个体证实无感染。

口蹄疫的血清学检测有两种:检测病毒结构蛋白(SPs)的抗体和检测病毒非结构蛋白(NSPs)的抗体。

检测疫苗免疫和感染引起的特异性SP抗体,通常采用病毒中和试验(VNT)、固相竞争ELISA(SPCE)和液相阻断ELISA(LPBE)方法。如果这个检测中使用的毒株或抗原与田间流行毒株是紧密匹配的,这些方法便具有血清学特异性和高度敏感性。它们是贸易中指定的检测方法,这对于确定非免疫动物已经感染或正在感染,以及监控疫苗在田间的免疫力都是合适的。VNT需要细胞培养设施,使用活病毒,并且需要2~3天才能提供结果。ELISA利用血清型专一的单克隆抗体或多克隆抗体的阻断或竞争ELISA,具有操作更快、不需要组织培养和动用活病毒等优点。用ELISA进行筛选,少数血清会出现低滴度的假阳性,可再经VN试验确定阳性,以减少假阳性结果的出现。参考血清可校准口蹄疫SP血清学检验,这些血清可从Pirbright参考实验室获取。

口蹄疫病毒非结构(NS)蛋白抗体可检测7个血清型病毒任何一种病毒(过去或当前)感染以及与接种疫苗的鉴别诊断。因此,这种检测可用于确诊口蹄疫疑似病例、检测病毒感染或证实动物群无感染。对于证明贸易中的动物,NS检测优于SP检测法,因为可以不必知道感染病毒的血清型。然而,有一些实验证据,一些免疫随后用活病毒攻击,并证明持续感染的牛,有些NSP抗体检测没被检出,而产生假阴性结果。这些检测方法通过重组技术在体外表达系统中大量生产的抗原检测非结构蛋白的抗体,多聚蛋白3AB或3ABC抗体被认为是最可靠的感染指标。在3AB或3ABC血清抗体阳性动物中,检测到抗一种或多种其他NS蛋白,可进一步确认感染。然而,在重复接种的动物中,由于疫苗制备时痕量NSP的存在,可导致假阳性反应,因此,必须重点考虑疫苗纯度。

已研制出用于检测牛的国际标准血清,可从巴西和英国的OIE参考实验得到。将来,绵羊和猪的标准血清也可以得到。牛血清平台也已建立,可以比较NSP检测的敏感性。

1、病毒中和试验(国际贸易指定试验)

在组织培养平底微量滴定板中,用IB-RS-2、BHK-21、羔羊或猪肾细胞作口蹄疫抗体定量微量中和试验。

2、固相竞争酶联免疫吸附试验(国际贸易规定实验)

这种方法可用于检测口蹄疫病毒的7个血清型的抗体。合适的单抗可用于包被ELISA板作为捕获抗体或结合过氧化酶检测抗体,可替代豚鼠或兔抗血清。检测O型抗体的商品化试剂盒可以买到。使用口蹄疫病毒7个血清型146S抗原的兔抗血清作为捕获抗体,在实验前将该血清用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释成最适浓度。

3、液相阻断酶联免疫吸附试验(国际贸易指定试验)

用BHK-21细胞培养特定的口蹄疫病毒毒株制备抗原。用未纯化的上清作2倍系列稀释进行预滴定,但血清不用作2倍系列稀释。加入等量稀释液后,将滴定曲线线性区的上端光密度值(光密度值约1.5)所对应的稀释度作为确定的最终稀释浓度。含0.05%吐温-20和酚红指示剂的PBS(PBST)作为稀释液。本试验其他试剂与固相阻断ELISA相同。


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