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降解黄曲霉毒素可以用生物方法这几点入手

日期:2017-07-10 10:42:17

黄曲霉毒素(aflatoxin简称AFT或AT)主要由基因同源的黄曲霉和寄生曲霉等真菌在一定的环境条件下发生的复杂酶促反应生物合成的次级代谢产物。目前鉴定出的共有18种,分为B族和G族两大类,在动物体内代谢可产生黄曲霉毒素M1、M2 等多种同源衍生物。它给粮食及饲料造成严重污染,其中黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中毒性最强的物质。黄曲霉毒素主要作用于肝脏,引起肝脏病变。食用了含黄曲霉毒素的食物,可引起人畜急性中毒从而引发疾病,且黄曲霉毒素有强致癌、导致基因突变和畸形作用,严重威胁动物及人类健康,如何除去粮食及饲料中的黄曲霉毒素被人们广泛关注。

1、黄曲霉毒素常规脱毒方法

1.1 物理化学方法脱毒

黄曲霉毒素常规脱毒方法有物理方法和化学方法。物理学方法包括霉变部分筛选剔除法、射线辐射降解法、高温加热处理法、溶剂萃取法,这些方法对除去黄曲霉毒素有一定效果。在实际操作中,筛选剔除法过程繁琐,射线辐射法对不同样品的处理效果存在很大差异,高温加热会破坏饲料中的营养成分,同时射线辐射和高温处理将会产生大量能源消耗,有机溶剂萃取产生的废物无法很好的处理。从而这些方法都很难在大规模批量生产中应用。

化学处理方法是用化学试剂破坏黄曲霉毒素的化学结构,其中内酯环存在于黄曲霉毒素的一般结构式中,只有内酯环被打开时,荧光才会消失,毒性才会消除。化学处理方法包括氨化、碱化和臭氧等处理方法,其中氨化和碱化处理是通过化学作用使黄曲霉毒素内酯环破坏,生成相应的香豆素铵盐或者钠盐,从而消除黄曲霉毒素的毒性;臭氧的氧化功能打开黄曲霉毒素内酯环,消除黄曲霉毒素的毒害。但这些方法虽然对去除黄曲霉毒素有一定效果,但在脱毒时,会产生有毒有害化学成分残留,破坏饲料产品品质,且臭氧处理成本高,不易操作,此方法同样很难应用在规模化生产中。

1.2 吸附方法脱毒

在工业生产中,一种是以添加蒙脱石、沸石、膨润土等硅酸盐吸附剂以及纳米吸附剂的物理吸附来去除霉菌毒素,其吸附原理是硅酸盐吸附剂强大的表面积与静电作用,与带有离子极性的霉菌毒素结合。其中硅酸盐吸附剂对黄曲霉毒素有很好的吸附能力,刘媛婷等通过体外实验表明水合铝硅酸盐对黄曲霉毒素的吸附率可达到99%,且吸附剂能够明显减轻黄曲霉毒素对动物的毒害作用。史莹华等通过猪日粮中添加蒙脱石吸附剂,显著降低了黄曲霉毒素对动物肝脏的毒害作用。但硅酸盐吸附方法在吸附毒素的同时会吸附氨基酸、维生素等营养成分,使饲料中的营养成分含量降低,其中存在着动物体内代谢过程重新被暴露的风险。此方法有待于进一步优化,明确吸附剂在动物体内的代谢过程,减少吸附剂对营养物质的吸附。

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另一种吸附方法是利用微生物对黄曲霉毒素吸附,研究较多的是酵母菌和乳酸菌的吸附作用,常见的有酿酒酵母、鼠李糖乳酸杆菌、干酪乳杆菌等。酵母菌的细胞壁电镜下为“三明治”结构口 ,其细胞壁的特殊结构和成分形成的分子作用力吸附黄曲霉毒素,Hernandezmendoza等利用缓冲液重复洗涤来评价酿酒酵母一黄曲霉毒素复合物的稳定性,实验结果表明酿酒酵母能稳定的与黄曲霉毒素结合,防止黄曲霉毒素被胃肠道吸收;Shah等发现黄曲霉毒素B1与乳酸茵形成黄曲霉毒素B1-乳酸菌复合物来吸附黄曲霉毒素。Redzwan等通过建立体外动物模型和人类临床试验,表明益生菌添加剂可以减少黄曲霉毒素在人类膳食和动物饲料中的暴露,降低和缓解黄曲霉毒素在人体和动物体内的毒害作用,最终被应用于饲料工业。但微生物的吸附作用为物理吸附,是一个可逆的过程,毒素不能完全被吸附,也存在着在动物体内毒素被释放的风险,单一的微生物吸附对黄曲霉毒素的解毒作用存在一定的局限性。

2、生物学方法降解黄曲霉毒素

生物学方法降解黄曲霉毒素,是近年来研究热门的一种脱毒方法,主要为微生物的降解,包括真菌和细菌两大类。在黄曲霉毒素生物方法降解的研究中,大量的利用筛选得到能够降解黄曲霉毒素的生物菌种,通过自身代谢产生某种胞内酶或者胞外酶将黄曲霉毒素分子的毒性基团降解为无毒害的物质被生物利用或通过代谢排出体外。另一方面通过生物酶的单一活性成分对黄曲霉毒素进行降解为无毒的其他组分,但生物酶的来源、活性以及稳定性需要优化与提高。

2.1 真菌对黄曲霉毒素的降解作用

降解黄曲霉毒素的真菌,包括寄生曲霉菌、根霉菌、白腐真菌、假密环菌和黑曲霉等 引。国外对真菌的研究较早,Doyle等通过发酵发现寄生曲霉在生长14 h后,菌丝产生一种乳过氧化物酶将黄曲霉毒素B1降解,其产物为黄曲霉毒素B2a的衍生物和另一种水溶性衍生物,降解产物的毒性远低于黄曲霉毒素B1。Cole等通过同位素标记法研究表明根霉菌能够将黄曲霉毒素降解为两个具有荧光的羟基化合物。Motomura等从一种平菇中分离出降解黄曲霉毒素的酶,通过荧光含量的测定,表明这种酶能够降解黄曲霉毒素的内酯环,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)得到其蛋白分子量大小大概为90 ku。

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国内对黄曲霉毒素的真菌降解研究中,李冰等研究黑曲霉发酵对黄曲霉毒素B1的降解效果,在一定件条下黄曲霉毒素B1 的降解率达到93.28%,在对其胞外粗提液、活细胞、细胞提取物降黄曲霉毒素进行分析时,发现其中黑曲霉的胞外粗提液对黄曲霉毒素的降解率最高,表明黄曲霉毒素B1的降解可能是黑曲霉分泌的一种酶的化学作用。徐丹等通过研究黑曲霉对黄曲霉生长、产毒以及对黄曲霉毒素的影响,验证了黑曲霉既能抑制黄曲霉生长、产毒,又能够降解黄曲霉毒素。

刘大岭等发现食用型真菌假密环菌能够降解黄曲霉毒素,其活性物质为一种胞内的氧化酶,提取的粗酶液能够高效降解黄曲霉毒素,降解效率达到80%;随后从提取物中分离出能降解黄曲霉毒素毒性的解毒酶,通过SDS-PAGE测定活性蛋白大小表观分子量为51.8 ku;进一步构建互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库并建立原核克隆及表达载体,得到重组黄曲霉毒素解毒酶活性蛋白(ADTZ),基因大小为2 088 bp,编码695个氨基酸,并成功的将黄曲霉毒素解毒酶基因在毕赤酵母中表达;对黄曲霉毒素解毒酶三维结构外层部位的关键氨基酸残基进行了改造,获得了一种对胰蛋白酶抗性提高的重组黄曲霉毒素氧化酶(AFO),其基因片段大小为2 321 bp,对胰蛋白酶的抗性比黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)提高2.73倍,半衰期延长了72min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。

以上研究表明,真菌微生物降解黄曲霉毒素的机理是一个复杂过程,易受环境和自身因素影响,可控性、稳定性差,降解产物不明确,但真菌中的单一活性成分对黄曲霉毒素有很好的降解效果。目前国内外对黄曲霉的研究更多的是黄曲霉毒素产生和降解机理的研究。

2.2 细菌对黄曲霉毒素的降解作用

国内外对细菌生物降解黄曲霉毒素有大量的报道,研究表明许多细菌微生物具有一定的降解黄曲霉毒素的能力。国外的研究中,Lilleho等1966年通过筛选酵母菌、霉菌、细菌、放线菌、藻类和真菌孢子降解黄曲霉毒素的能力,最终筛选出橙色黄杆菌能够降解黄曲霉毒素B1,Doyle等证明这种物质为一种乳过氧化物酶。Smiley等进一步报道橙色黄杆菌的粗蛋白质提取物在水溶液中降解黄曲霉毒素B1的降解率能够达到74.5%;分别用热处理、脱氧核糖核酸酶I处理、蛋白酶K处理初蛋白质提取物,降解率分别为5.5 %、80.5% 、34.5%,进一步验证这种对黄曲霉毒素的降解机理可能是酶促反应。Cserhati等筛选出32株红球菌菌株能够降解黄曲霉毒素,利用发酵培养、酶联免疫吸附法(EUSA)检测,结果有16株菌株对黄曲霉毒素的降解效率达到100%,4株菌株的降解效率达到98%。

国内对黄曲霉毒素的细菌降解研究中,李俊霞等利用香豆素,从动物粪便、发霉粮食、实验室原有菌株等1 500种微生物细菌和芽孢杆菌样品中筛选出能够降解黄曲霉毒素的菌株,并用黄曲霉毒素B1作为培养基底物进行复筛,共得到来自肠道的8株菌株和来自发霉饲料的2株菌株能够降解黄曲霉毒素,其中从貘粪便中获得的假单胞菌属嗜麦芽窄食单胞菌对黄曲霉毒素的降解效果最好。关舒等对嗜麦芽窄食单胞菌培养基胞外粗提液、活细胞和细胞提取物分别进行降解黄曲霉毒素处理,37℃下孵育72 h后检测胞外提取物中黄曲霉毒素B1减少了82.5%,而活细胞提取物对黄曲霉毒素的降解效率非常低,用蛋白酶K,蛋白酶K加十二烷基硫酸钠(SDS)和加热处理培养物上清液能显著降低或根除培养物上清液的降解活性。证明其中的嗜麦芽窄食单胞菌对黄曲霉毒素的降解为生物酶的降解。

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雷元培等对枯草芽孢杆菌进行降解黄曲霉毒素解毒的生物活性、抗菌性及抗逆性的研究。实验结果表明,发酵后的上清液中存在解毒活性组分,对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后,解毒活性显著降低,表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶,同时所分泌的活性蛋白具有强解毒活性,特异性和作用效果温和的特点,不会破坏饲料中的营养成分,适用于除去饲料中的黄曲霉毒素。

3、前景展望

目前,生物防治黄曲霉毒素研究取得了一定的进展,但国内外使用生物学方法降解黄曲霉毒素在饲料工业中的应用刚刚起步。黄曲霉毒素虽能被不同的菌株所降解,但目前的防治方法依然还存在着许多问题,一般研究主要侧重于降解黄曲霉毒素菌株的筛选,但对于降解的机理及解毒酶特性需要进一步研究。黄曲霉毒素分解酶相关的基因报道还比较少,且酶的产量和活性不太高,毒素不能被完全降解。因此,需要用到生物化学、分子生物学、基因工程的手段对微生物菌种进行筛选及改造,并获得黄曲霉毒素分解酶的组成基因并进行高效表达,开发出能够高效降解黄曲霉毒素的生物菌种。将生物发酵技术应用于饲料工业,以减少饲料的污染和浪费,降低养殖行业和饲料行业经济成本。


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