邹盼盼1，王春江2，曹省艳3

杨阳1，王迈4，齐雪峰1

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河北威远药业有限公司，河北石家庄 050000；3.绵阳市动物疾病预防控制中心，四川绵阳 621000；4.石家庄市农业综合行政执法支队，河北石家庄 050000)

在生猪养殖业中，仔猪出生后 3~5 周实施断奶极易产生应激反应，主要表现为精神萎靡、食欲不振、腹泻或者其他肠道疾病，甚至导致死亡[1]。随着集约化养殖的发展，虽然生产实践中通过在日粮中添加抗生素可有效改善仔猪断奶应激，但长期使用抗生素会蓄积于动物体内，并且残留在各种动物性食品中，威胁食品安全且污染环境。除此之外,还会产生细菌耐药性问题，形成恶性循环[2]。我国于2020年7月禁止一切抗生素药物应用于饲料添加剂。因此，探寻绿色、高效的抗生素替代产品对我国养猪产业健康可持续发展具有重要意义[3]。现广泛应用的抗生素替代药物有植物提取物^[4]、酸化剂[5]、酶制剂[6]等。植物精油(plant essential oils,PEO)是从各种植物中提取的具有抑(杀)菌、抗炎、抗氧化等作用的活性物质。目前在畜牧业上应用最为广泛的 PEO 有 3 种，分别为百里香酚、香芹酚和肉桂醛，其中百里香酚主要来源于百里香、牛至，香芹酚主要来源于中草药牛至，肉桂醛是中药肉桂的主要活性成分[7-9]。

有研究指出，在断奶仔猪基础日粮中添加250 mg/kg的百里香酚和香芹酚，能显著提高断奶仔猪的生长性能和对营养物质消化吸收的能力[10]。但也有不同研究结果指出,在断奶仔猪基础日粮中添加 500 mg/kg 百里香酚或者 18 mg/kg 的百里香酚和肉桂醛均不能显著提高仔猪的生长性能，但能显著提高仔猪免疫能力，降低腹泻率[11-12]。由此可见,不同种类的植物精油、不同添加水平,对断奶仔猪的效果也不同。此外，有研究表明，在畜禽日粮中添加牛至精油(有效成分为百里香酚和香芹酚)能改善仔猪肠道菌群结构[13]。在早期断奶仔猪日粮中添加 0.3%肉桂醛或 0.5%香声酚，均能提高仔猪肠道内乳酸杆菌的丰度，降低肠杆菌的含量，降低仔猪腹泻率[14-15]。

在无抗养殖背景下，传统中药在养殖领城逐渐为人们所接受，PEO 作为替抗产品受到越来越多的关注，然而现有的文献支持以单体精油为多，对复合植物精油在畜禽生产上的研究偏少。因此，为推广复合植物精油在养猪产业的合理应用，本研究选用由百里香酚、香芹酚和肉桂醛配制的复合植物精油为研究对象，将其添加到断奶仔猪日粮中，探究其对断奶仔猪作用60d后，对仔猪生长性能和肠道结构的影响。

1.1 材料

1.1.1 复合精油主要成分  百里香酚、肉桂醛、香芹酚三者配比为 1:1:1。

1.1.2 主要试剂  百里香酚、肉桂醛、香芹酚，河北威远药业有限公司产品；10%福尔马林、HE 染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司；二甲苯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心产品；DNA 抽提试剂盒(E.Z.N.A.®Soil DNA Kit)，美国Omega Bio-Tek公司产品；琼脂糖(biowest agArose)，西班牙biowest公司产品；FastPfu Polymerase，中国 TransGen 公司产品；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit ( Axygen Biosciences)，美国Axygen公司产品；建库试剂盒(NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit)，美国 Bioo Scientific 公司产品；测序试剂盒(MiSeq ReagentKit v3/NovaSeq Reagent Kits)，美国 Illumina 公司产品。

1.1.3 主要仪器  移液器(Eppendorf N13462C)、小型离心机(Eppendorf 5430 R)、高速台式离心机(Eppendorf 5424R)，德国 Eppendorf 公司产品；小型离心机(ABSON MiFly-6)，合肥艾本森科学仪器有限公司产品;超微量分光光度计(NanoDrop2000),美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；酶标仪(BioTek ELx800)，美国 Biotek 公司产品；旋涡混合器(QL-901)，海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；粉碎研磨仪(TL-48R)，上海万柏生物科技有限公司产品；电泳仪(DYY-6C)，北京六生物科技有限公司产品; PCR 仪(ABI Gene-Amp@ 9700 型),美国 ABI 公司产品;测序(Illumina Miseg),美国 Illumina 公司产品；正置显微镜(Ni-U)，日本尼康公司产品；超薄切片机(EMUC7)，奥地利徕卡仪器有限公司产品;

1.2 方法

1.2.1 试验设计与饲养管理  选用 22 日龄断奶、体重相近的大白×长白×杜洛克三元杂交阉公猪，随机分为两组，每组10头，群栏饲养。对照组和试验组分别饲喂基础日粮和添加复合植物精油的试验日粮，添加量为500 mg/kg。各组均处于同一饲养条件下，预试验7d，正式试验期为60d，由专业人员进行饲养并定期记录试验数据，试验期内全部试验仔猪饮水采食自由，正常免疫，定期对猪舍进行消毒。

1.2.2 试验日粮  基础日粮参照中国瘦肉型生长猪饲养标准(2004)配制。

1.2.3 生长性能  分别于试验正式开始和结束时对每组仔猪空腹称重,记录初重、末重、日采食量，计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)、料重比(F/G)。同时记录每栏每天仔猪腹泻头数和死亡情况，计算仔猪腹泻率。

1.2.4 肠道样品采集与处理  于试验结束时，每组随机选择 4 头仔猪，屠宰后，打开腹腔分离肠道，暴露直肠，在骨盆腔中单结扎，取出全部肠道。再按十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠等不同肠段分别进行两端结扎并分离各段消化道。然后用灭菌剪刀从肠道各段截取约 2 cm X 2 cm(各肠段分别采集 2~3份作为试验和备份)，用无菌生理盐水将上述组织内壁轻轻冲洗干净，至内壁没有肉眼可见的黏附内容物为止，放入10%福尔马林密封编号后保存。

用灭菌医用剪刀从十二指肠、直肠中部剪开一个小口，再用灭菌药勺挖取大约 2 g 内容物分装到已灭菌的 2 mL冻存管中(各肠段分别采集 2~3 份作为试验和备份),编号、旋紧螺盖后迅速放入液氮或一80C超低温冰箱中保存待用。

1.2.5  肠道长度的测量与肠道组织苏木精-伊红染色  将完整取出来的肠道放到试验台，及时测量肠道长度。然后将固定的肠组织取出，参照常用的实验方法来制作石蜡切片,试验步骤包括冲水、脱水、透明、包埋切片和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin.HE)染色。每组选取3个样品切片，低倍镜下(4X)每张切片选出5个典型的视野观察肠黏膜形态，观察过程中应注意所选取的肠绒毛长度应该基本一致，通过正置显微镜进行拍照。运用软件 Image-J测量绒毛的高度、隐窝的深度，并计算出绒隐比。

1.2.6 测序  将采集的十二指肠、直肠内容物送往上海美吉生物医药科技有限公司测序,通过美吉生物云平台对测序结果进行交互分析。

1.2.7 数据整理与分析  先通过 Excel2016 对初始数据进行整理，然后对断奶仔猪生长性能和肠道结构影响部分,结果通过 SPSS 19.0 统计软件进行 t 检验，以最小显著性差异法(least-significant differ-ence,LSD)进行多重比较，结果均以平均值 ± 标准误(Mean ± SE)表示；对断奶仔猪菌群结构影响部分，结果进行 Wilcoxon 秩和检验，结果均以平均值士标准差(Mean ± SD) 表示。以 P<0.05 表示差异显著。

2.1 植物精油对仔猪生产性能的影响

由表 1可知，与对照组相比，试验组仔猪 ADG、ADFI均显著高于对照组(P＜0.05)，仔猪腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，F/G 低于对照组。