陈同煜1，宁慧波2，彭涛1，王玉超1，古金元1，胡东方1，刘思当1
1.山东农业大学动物科技学院；2.海博莱生物科技咨询（北京）有限公司

　　副猪嗜血杆菌所引起的副猪嗜血杆菌病是严重危害养猪业健康发展的一种重要细菌性疾病。近年来，由于早期断奶方案和保育圈高密度饲养特性，造成副猪嗜血杆菌病在保育仔猪阶段呈高发态势。另一方面，一些病毒性疾病如猪圆环病毒病、蓝耳病、伪狂犬病、猪流感、猪瘟等病毒病的流行造成猪群免疫力低下，也为副猪嗜血杆菌的感染提供了可乘之机，尤其是蓝耳病病毒和圆环病毒2型与副猪嗜血杆菌混合感染的病例显著增加。大量临床资料证实，完善病毒性疾病的免疫防控和应用合理的药物防治措施可显著降低该病的发病死亡率。但进入中后期的病例则抗生素治疗效果较差，也可以说已不可治愈。所以该病的平时预防和早期确诊及敏感药物的前期治疗尤为重要，现介绍一起山东省泰安地区某规模化猪场副猪嗜血杆菌病典型病例的诊断与防治。
　　1　背景
　　山东省泰安市某规模化自繁自养猪场现有存栏母猪80头，保育猪400头。2016年11月5日发现该猪场20余头40日龄左右的保育猪出现高热（40.5℃～42℃），精神沉郁，食欲不振，咳嗽、气碶-、呼吸困难，部分病猪体表被毛粗乱，消瘦跛行，伴有腹泻等临床症状。猪场兽医对病猪注射了板蓝根针剂，并投服替米考星、微生态制剂类药物，效果欠佳；病猪1周左右死亡，疫情逐步扩大，一周后保育舍发病率20%，死亡率达60%，遂前来就诊。
　　2　综合诊断
　　2.1　临床检查
　　送检病猪主要表现后肢关节肿胀，无法站立，呈“犬”坐姿势；精神沉郁，呼吸极度困难，咳嗽、气碶-；眼睑肿胀，耳朵及腹部皮肤呈紫红色，耳尖发绀，其他未见明显异常。
　　2.2　剖检病变
　　对送检病猪颈动脉放血致死，剖检发现病猪下颌与腹股沟淋巴结出血肿大（图1-A）；胸、腹腔大量积液（图1-B、图1-C）；胸腹膜、心、肺、肝、脾、肠道、膀胱等组织器官表面纤维素渗出并造成不同程度的黏连（图1-D、图1-E）；肺脏暗红色肿大，触之有实变；肝脏淤血肿大；脑膜充血水肿（图1-F），其他未见明显异常。

图1　病猪剖检病变

2.3　组织病理学病变
　　对剖检猪的脑、肺、肝、脾、淋巴结及扁桃体取样，10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，镜检。可见典型化脓性脑膜炎病变，脑膜血管充血、出血，周围有大量中性粒细胞浸润（见图2-A、图2-B）；肺泡壁毛细血管充血，肺泡腔和支气管内有大量中性粒细胞浸润（见图2-C、图2-D）；肝脏淤血，肝窦增宽，被膜表面有纤维素性渗出物及炎性细胞（见图2-E、图2-F）；脾脏充血，纤维素性渗出区域充满大量中性粒细胞，并可见炎性细胞坏死崩解（见图2-G）；扁桃体毛细血管充血，隐窝扩张，内含浆液及中性白细胞（见图2-H）；淋巴结被膜、小梁及实质中毛细血管充血，水肿，呈浆液性淋巴结炎病变（见图2-I、图2-J）。

图2　病猪组织病理学变化

图3　分离菌株革兰氏染色（1000×）

2.4　细菌分离培养及鉴定
　　采集肺组织划线接种于含新生牛血清（终浓度10%）和NAD（终浓度20g/ml）的TSA培养基上，37℃培养24h～48h后挑取疑似菌落进行传代纯化，培养24h～48h后可见针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落形态。革兰氏染色镜检，观察到菌体呈革兰氏阴性细小杆菌，有多种不同形态，从单个球杆菌到细丝杆菌不等（图3）。同时，挑取细小单菌落接种于含新生牛血清（终浓度10%）和NAD（终浓度20g/ml）的TSB液体培养基中进行增菌，37℃、12h后挑取菌液进行PCR鉴定。根据GenBank公布的序列设计副猪嗜血杆菌（HPS）的特异性引物（见表1，綷-验证均具有较好的特异性和扩增效率），用PCR/RT-PCR方法扩增后，将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像仪下根据条带位置判定病猪的病原感染状况（图4）。

表1　PCR/RT-PCR引物序列

注：M为DL 2000 Marker；+为阳性对照；S为检测样品。

图4　1.5%琼脂糖凝胶电泳

2.5　生化鉴定
　　将分离纯化得到的疑似菌落分别接种于H2S、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、脲酶、触酶、氧化酶、吲哚、硝酸盐微量生化鉴定管中，每支生化管中同时加入1μL犊牛血清和1μL NAD的（V因子），置于37℃恒温培养箱，培养24h～48h，观察结果（见表2）。其中H2S、木糖、甘露醇、脲酶、氧化酶、吲哚反应呈阴性，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、触酶、硝酸盐反应呈阳性，符合副猪嗜血杆菌生化特性。

表2　生化特性培养结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。
　　2.6　药物敏感试验
　　用灭菌接种环挑取纯化菌落均匀涂布于一新鲜含NAD及犊牛血清的TSA平板上，然后用无菌镊子将药敏片（每片含量5μg）按一定间隔分别平贴于培养基表面，于37℃ CO2培养箱中培养24h，根据抑菌圈直径（φ）判定细菌对药物的敏感程度。判定标准为：φ≥25mm为极度敏感；15mm≤φ＜25mm为高度敏感；10mm≤φ＜15mm为中度敏感；φ＜10mm为低度敏感；无抑菌圈则为耐药。结果显示，头孢噻呋钠、强力霉素和恩诺沙星高敏，庆大霉素、阿莫西林和四环素中度敏感，氟苯尼考低敏，林可霉素、青霉素不敏感。
　　3　结论
　　结合该猪场发病猪流行病学、临床症状、剖检病变及上述相关实验室检测，确定本次疫情为副猪嗜血杆菌感染所致。
　　4　防控
　　研究发现，各地分离到的副猪嗜血杆菌的血清型复杂多样，按Kieletein和Rapp-Uabr-iedSon琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20%以上的分离株不能定型，各型之间交叉保护力弱。目前市面流通的副猪嗜血杆菌油乳灭活疫苗所含血清型各有差异，并不能对某区域流行的副猪嗜血杆菌提供特异性保护，当发生副猪嗜血杆菌病时，首先需对病原菌进行分离及血清鉴定分型，明确该区域内流行的主要血清型，然后选择合适的疫苗对发病猪群进行疫苗免疫。另外，对病情较重的中小规模猪场适宜抗生素的应用可能更为行之有效。但随着抗生素的大量使用，该菌对常用抗生素的耐药性越来越高，且不同地区不同副猪嗜血杆菌菌株敏感药物各不相同，因此需分离病原菌进行药敏试验，筛查敏感药物以进行有效防控。试验证明，该病例分离菌株对头孢噻呋钠、强力霉素、恩诺沙星高度敏感，在此基础上提出了防治方案。
　　4.1　隔离病猪
　　为避免交互感染，及时挑离发病猪只，单独隔离饲养，对发病严重且无治疗价值猪只及时淘蘚-。
　　4.2　卫生消毒
　　彻底清理发病猪舍卫生，尤其注意对猪舍空气及饲养环境的消毒，可采用火焰喷灯喷射猪舍地面及墙壁，并加强料槽、水槽等用具的洗刷消毒。
　　4.3　药物保健程序
　　对该病的治疗需早发现、早诊断、早治疗，并筛选敏感药物对症治疗。
　　对发病严重猪只应用头孢噻呋注射液，5mg/kg，肌肉注射，每日1次，连用5d；病猪群用强力霉素20g/100kg水，连续饮水5d。
　　整体保育猪群断奶后1d～5d，强力霉素20g/100kg饲料，水溶解喷洒颗粒料，连用5d；断奶后11d～15d，包被恩诺沙星20g/100kg饲料拌料，连用5d。
　　保育圈仔猪饲料中添加维生素C或黄芪多糖，提高机体抵抗力，减少应激反应。
　　4.4　加强饲养管理
　　降低猪只饲养密度，改善猪舍通风环境，定期卫生消毒，保持圈舍清洁干燥。
　　通过实施以上综合防控措施，使该猪场保育猪副猪嗜血杆菌病得到了有效控制，猪场逐步恢复稳定生产。
　　刘思当 Email：liusid@sdau.edu.cn