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禽白血病病毒检测方法

日期:2020-08-17 13:22:47

摘   要

禽白血病是由禽白血病病毒引起的一种禽的肿瘤性传染性疾病,使感染鸡的生产性能下降,引起免疫抑制和死亡,造成重大的经济损失。目前防制该病的主要措施是净化,其中禽白血病病毒的检测在净化中起到关键作用。本文从禽白血病病毒的实验室检测方法做一简要综述,希望能对种鸡场禽白血病的检测与净化提供一定的参考。


禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)感染引起的家禽的肿瘤性疾病,临床上以淋巴白血病最为常见。根据宿主范围、病毒间的干扰作用及抗原特性分析,将禽白血病病毒分为A~K等11个亚群,其中 A、B、C、D、E、J 和 K 等 7 个亚群能感染鸡。危害我国养禽业的主要有J、A和B 3个亚群,其中J亚群对我国鸡群的危害性最大。感染禽白血病的鸡群生长受到抑制,多种组织器官出现肿瘤,甚至出现免疫抑制等,给我国养禽业带来了巨大的经济损失。禽白血病既可以水平传播,也可以垂直传播。孵化场、育雏舍的雏鸡,可以通过胎粪、直接接触等途径将病毒传播给其他鸡。种鸡群可以通过精液、种蛋等将病毒传播给下一代鸡群。垂直传播是禽白血病最主要的传播方式。另外,被禽白血病病毒污染的弱毒疫苗也是重要的传播途径。由于国内外没有有效的疫苗和药物来预防和控制禽白血病,禽白血病被列为《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的重点防制对象和净化目标。通过选择有效的方法对种鸡群中的禽白血病病毒进行检测,是净化和预防该病的重要环节。


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病毒的分离与培养


病毒的分离培养是传统的也是公认的检测家禽是否感染 ALV的可靠方法。通常采取发病鸡或可疑鸡的胎粪、泄殖腔拭子、血液、血清、精液、肿瘤组织和蛋清等,处理后,接种CEF细胞或DF1细胞上,增殖培养5~7天。由于大多数ALV接种细胞后,不能产生细胞病变,通常需要收获培养物后,再借助酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)等方法检测ALV,并进行ALV的亚型鉴定。该方法的特异性强,能够确切地判断鸡群是否感染了ALV。但该方法操作周期长,需要专业的技术人员和专业的仪器设备,目前该方法主要在科研院所、高校和一些大型的种禽场采用。


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血清学检测


血清学检测主要是利用特异性抗原与特异性抗体相结合来检测的一种方法。用于禽白血病病毒检测的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(NT)、琼脂扩散试验(AGP)和间接免疫荧光试验(IFA)等。


2.1  酶联免疫吸附试验


ELISA是目前禽白血病病毒检测最常用的方法。该方法既可以检测病原,也可以检测抗体,具有敏感、快捷和一次大批量检测等优点,广泛地应用在我国种鸡场禽白血病的净化过程中。2006年, 叶建强、秦爱建等利用ALV-J 的囊膜蛋白特异性单克隆抗体,建立了针对ALV-J env抗原的ELISA检测方法。Bingling Yun等利用ALV p27蛋白的单抗和多抗,建立了检测ALV-A、ALV-B和ALV-J的抗原捕获ELISA方法。2013年,廖亚琳等利用ALV-J的gp85单因子抗体,成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法。ELISA检测方法在国内种禽场白血病的调查和净化工作中,发挥了重要作用,但该方法也存在一些缺点。由于ALV p27抗原在内源性和外源性ALV中高度保守,若鸡群中内源性的ALV-E表达量高,可能会导致“假阳性”结果的出现。因此,种鸡场在开展禽白血病的净化检测时,如果种鸡的价值高,出现阳性结果时,可以结合ALV在DF-1细胞上的分离鉴定结果来判断鸡群是否感染了外源性ALV。


2.2  病毒中和试验(NT)


NT是一种较敏感的禽白血病病毒的检测方法,既可以检测 ALV,也可用于检测ALV抗体。由于特定亚群的ALV的表面抗原只能与特异性的抗体才能结合,所以该方法是一种经典的ALV检测方法,被实验室用于ALV亚群的鉴定。由于该实验对抗体的要求较高,且操作繁琐,耗时长,所以在临床检测和净化中较少使用。


2.3  琼脂扩散试验(AGP)


AGP利用ALV的抗原和抗体在凝胶内扩散、结合、形成沉淀,来检测禽白血病的病原或抗体。1986年,张晶等利用AGP试验,从羽髓中检测ALV群特异性抗原,操作简单,经济实用。该方法在早期种禽场白血病的净化过程中发挥了重要作用。但由于该方法的敏感性较差,可能会出现假阳性的情况,目前该方法已经较少使用。


2.4  间接免疫荧光试验(IFA)


IFA也是利用ALV的表面抗原和特异性的抗体结合,然后荧光素标记的抗体与特异性的抗体抗原复合物结合,形成抗原-抗体-抗抗体复合物体系,通过荧光显微镜观察来检测ALV的一种方法。该方法的敏感性和特异性较强。2002年,徐镔蕊等利用特异性抗ALV-J囊膜蛋白 gp85单克隆抗体对组织触片作间接荧光抗体试验,检测到了骨髓、食道、肌肉、输卵管和肾等组织中的ALV-J抗原。2014年,Qiu等研制了针对ALV-A的单克隆抗体,通过IFA试验鉴定ALV-A,特异性较好。但该检测方法操作复杂,且需要特异性的单抗和荧光显微镜,目前主要用于高校、科研院所等的实验室检测。


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分子生物学检测


用于禽白血病病毒检测的分子生物学方法主要有聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR、多重PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)等。


3.1  聚合酶链式反应


PCR方法能够检测鸡群组织、血液、细胞培养物及禽用活疫苗等样品中的ALV前病毒DNA,可用于特定亚群的快速检测。1998年,Smith等建立了ALV-J的PCR检测方法。随后国内外学者根据ALV特定亚群的基因序列,陆续建立了多种PCR的检测方法。由于PCR方法快速、灵敏,还可以避免内源性ALV的干扰,在ALV的诊断和疫病净化中被广泛应用。但如果ALV发生变异,该方法可能会导致假阴性。所以,在禽白血病病毒的分子检测中,应还能结合病原的分离鉴定和ELISA方法。


3.2  反转录PCR和荧光定量PCR


RT-PCR能够检测鸡群组织、血液、细胞培养物及禽用活疫苗等样品中的ALV的RNA。通常提取待检测样品中的RNA,反转录后,检测方法同PCR。与PCR相比,RT-PCR敏感性更高,但却无法对模板中的RNA进行定量。荧光定量PCR,不但实现了模板的定量, 且具有特异性更强、重复性更好的优点。2015年,Manman等建立了SYBR Green I实时PCR方法,可以对ALV-A、ALV-B和ALV-J进行鉴别诊断。在禽白血病病毒的检测中可根据需要,合理地选择相应的方法。


3.3  环介导等温扩增技术(LAMP)


由于LAMP方法具有灵敏度高、反应时间短、不需要特殊仪器,操作简单的优点,也广泛用于ALV的检测中。2010年,Zhang X T等,建立了针对ALV-J的可视化LAMP检测方法,该方法敏感性高,可在1小时内完成整个过程,适用于临床样品的快速检测。2015年,Hao Peng等建立了可以同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-E和ALV-J的LAMP方法,该方法特异性强,敏感性高,快速便捷。


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小结


《国家中长期动物疫病防治规划(2012- 2020年)》和《全国肉鸡遗传育种改良计划(2014-2025)》都将禽白血病列为优先防控动物疫病和首批动物疫病净化对象。经过十年来的净化工作,已有部分种鸡场成功实现了禽白血病的净化工作。但由于我国种鸡场数量众多,饲养管理水平差异较大,净化工作任务艰巨。净化过程中要对禽白血病进行确诊,其中病毒的检测是重要的内容。生产上为了避免假阳性和假阴性结果的出现,确保检测结果的准确性,最好使用两种或两种以上的净化检测方法进行。


(本文摘自《养禽与禽病防治》2020年第2期,作者:刘海霞、郑继昌,单位:广东农工商职业技术学院热带农林学院)


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