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几种比较有潜力的口蹄疫新型疫苗的研究及应用情况

日期:2020-03-30 15:50:28

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口蹄疫新型疫苗研发的必要性

口蹄疫灭活疫苗自诞生以来已使用70多年,实践证明灭活疫苗可以有效的限制口蹄疫的流行范围。在与严格的政府防控政策结合时,甚至可以根除地方性口蹄疫。口蹄疫在亚洲、非洲、欧洲及美洲的许多国家都有发生,经过20世纪后半叶有效的疫苗预防接种,欧洲大多数国家和美洲部分国家都消灭了口蹄疫。目前除欧盟取消了口蹄疫灭活疫苗免疫接种政策外,南美和亚洲多数国家仍然在使用口蹄疫灭活疫苗预防和控制口蹄疫。

相比新型疫苗,口蹄疫灭活疫苗存在着免疫效果良好、生产工艺成熟等诸多优点。但是随着实践经验的积累和研究的深入,口蹄疫灭活疫苗的缺点也逐渐为人们熟知。第一,伴随着口蹄疫灭活疫苗的使用,对疫苗灭活是否彻底的争议一直在持续,有报道认为部分地区的口蹄疫流行是由口蹄疫疫苗中病毒灭活不彻底造成。因为怀疑甲醛灭活方法不可靠,人类抛弃了在疫苗生产中最为常用的甲醛灭活法,采用了乙烯亚胺类衍生物灭活法,但乙烯亚胺类衍生物会增加疫苗的毒副作用,最关键的是乙烯亚胺类衍生物对病毒灭活是否彻底依然存在争议。第二,口蹄疫灭活疫苗的生产过程中存在活病毒增殖以及对实验动物疫苗免疫后的抗病毒攻击实验,这些环节稍有不慎就有可能使病毒扩散从而造成口蹄疫的流行。虽然按照兽药GMP的要求以上环节都应该在负压的密闭环境中进行,但病毒粒子的扩散是无孔不入的,况且还存在人员的流动,没有人能够保证负压的密闭环境一定安全。第三,口蹄疫病毒基因组结构简单因此非常容易变异,一旦发生变异,使用原来流行毒株制备的疫苗对变异毒株的保护能力就会下降。为保持疫苗的保护力,学者们需要不断通过流行病学调查分析制苗毒株与流行毒株之间的差异,在差异变大时及时更换制苗毒株,使其与流行毒株相匹配。这给科研单位和疫苗生产企业增加了巨大的工作负担。基于上述原因,新型疫苗的研发势在必行。

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几种比较有潜力的新型疫苗的研究进展、研究及应用情况


(一)合成肽疫苗
合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白质序列为依据,用人工方法合成多肽并连接到大分子载体上作为抗原,加入佐剂制备的一类疫苗。20世纪60—70年代学者们发现口蹄疫病毒最重要的抗原决定簇位于VP1上。20世纪80年代,学者们开始尝试使用VP1蛋白作为抗原研制疫苗,实验证明VP1蛋白免疫动物具有一定效果,但还不足以保护动物免受口蹄疫强毒攻击。随着核酸测序技术和化学合成肽技术的发展,人们逐步发现VP1上的多个重要的抗原位点,于是用化学方法合成了这些抗原位点氨基酸序列并免疫兔子和豚鼠,发现140~160肽能刺激豚鼠产生高水平中和抗体,并能保护豚鼠抵抗强毒攻击。随后又发现,200~213氨基酸序列与140~160序列连接时具有更好的免疫效力,于是用这种合成肽制成疫苗,虽然用此疫苗免疫牛之后,其效力明显低于常规灭活疫苗,但这种方法开启了一种新疫苗的研究思路。

理想的合成肽应该有以下特点:(1)具有良好的免疫原性:研究证明,合成肽具有空间构象时能够提高在实验动物体内的应答水平;另外合成肽的抗原表位以二聚体或者多聚体形式存在时,免疫原性比单一表位的合成肽更强。(2)广泛的免疫交叉性:理想的合成肽疫苗应该是一次免疫能够预防多种血清型口蹄疫,为实现这一目标,Doel等把不同血清型口蹄疫病毒VP1蛋白141~158序列和200~213序列连接起来制成杂合体,实验证明这种杂合体序列可以诱导机体产生抗多种血清型的抗体。

研究发现,抗原表面T、B 淋巴细胞表位的存在,对引发较高的中和抗体水平有重要意义,而VP1蛋白上的序列同时具有T、B淋巴细胞表位,因此有学者将几个重复的135~144序列短肽制成疫苗,可以在牛体内引发较高的抗体水平。Chan等将O型口蹄疫病毒VP1蛋白的141~160序列和200~213序列插入猪IgG分子一条重链恒定区,构建了一种嵌合体蛋白,这种蛋白在猪和小鼠体内都引发了很好的免疫反应。

近些年中国在口蹄疫合成肽疫苗的研发方面取得了很大的成绩,中牧实业股份有限公司与上海申联生物医药公司共同研发了一种将口蹄疫病毒抗原表位与猪IgG重链恒定区连接,并在大肠杆菌中高效表达的蛋白作为抗原的猪口蹄疫O型合成肽疫苗。用此疫苗连续免疫猪两次,抗体阳性率可达100%,免疫群体可以抗1000ID50的病毒攻击。猪口蹄疫O型合成肽疫苗已获得农业部颁发的一类新兽药证书,是国内最成功的新型疫苗,目前已经开始商品化生产,并逐步在畜牧业生产中推广使用。有学者对猪口蹄疫合成肽疫苗和灭活疫苗的田间使用效果做过比较,合成肽疫苗不论在免疫后的抗体滴度或是在抗强毒保护方面效果都与灭活疫苗相当。相信随着使用范围的扩大,人们对合成肽疫苗的重视程度将会增加。

(二)基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗是指使用基因工程技术将编码病原微生物抗原表位的基因导入受体菌或者细胞,使其在受体中高效表达抗原,然后制备的一类疫苗。Kleid等将口蹄疫抗原基因导入大肠杆菌成功的表达了VP1融合蛋白抗原,并用此抗原制备了口蹄疫基因工程亚单位疫苗,在牛和猪体内均能诱导产生中和抗体,从此各国科学家开始广泛使用这种技术研发口蹄疫疫苗。

1979年就有学者发现A型口蹄疫病毒空衣壳在豚鼠体内的免疫原性与完整病毒粒子相同,而抗空衣壳血清与抗病毒血清也具有相同的特异性,由此开始了空衣壳亚单位疫苗研究。由于空衣壳缺少核酸而仅有蛋白外壳,免疫动物不能产生病毒的非结构蛋白,因此应用这种疫苗免疫动物,可以利用现有的诊断病毒非结构蛋白的血清学方法,简便地区分出免疫动物和感染动物。国内外均有研发空衣壳疫苗的报道,总体来说空衣壳疫苗虽然能提供一定的保护,但还不能达到灭活病毒所产生的保护效果,其主要原因是口蹄疫全病毒衣壳的表达量不高。

随着基因工程亚单位疫苗的研发,科学家逐步总结出研发这类疫苗的关键:(1)要鉴定出病毒的主要抗原位点。(2)选用合适的表达系统来表达抗原蛋白。最初学者们普遍采用原核表达系统表达抗原蛋白,后来发现原核表达的抗原蛋白引发的免疫保护很低,原因是原核表达系统对表达的蛋白进行修饰和加工的能力很有限,所以表达的蛋白常常只有线性表位而缺乏构象表位。

近几年真核表达系统越来越多的用于口蹄疫抗原蛋白的表达。开始使用较多的是酵母表达系统,后来发现昆虫细胞中表达的蛋白与哺乳动物细胞内表达的蛋白无论在结构上还是在免疫原性方面都非常相似,于是学者们把希望寄托于昆虫细胞表达系统上。然而昆虫细胞表达系统对生长环境要求很严格,需要高溶氧量才能生长,而且不耐机械搅拌和气泡冲击,因此不适于工业化大规模培养。有报道使用无血清油乳培养液悬浮培养昆虫细胞的新技术,不但能提供细胞生长所需的营养,而且能够对细胞形成保护,这种技术有可能使昆虫细胞表达系统的大规模培养成为现实。

除了以上的载体系统外,近几年有一些使用转基因植物表达口蹄疫病毒蛋白的报道。Usha等将编码口蹄疫病毒VP1抗原表位的核酸序列与豇豆花叶病毒(CPMV)的S蛋白基因连接后感染豇豆,此重组体病毒能够在豇豆细胞中复制并表达融合蛋白,这一试验揭示了使用植物生产口蹄疫疫苗的可能性。Wigdorovitz等研制出一种能够表达口蹄疫病毒VP1蛋白的转基因苜蓿,使用这种苜蓿的提取物免疫小鼠能使小鼠抵抗口蹄疫病毒攻击,另外还发现使用苜蓿叶片直接饲喂小鼠,也能诱导小鼠产生抗口蹄疫病毒的特异性免疫反应。这一试验为可饲疫苗的研发提供了思路。潘丽等将O型口蹄疫病毒P12X-3C 基因成功导入番茄和拟南芥中,该基因在植物种子中能够特异性表达,将番茄叶浸出物免疫豚鼠,可产生特异性抗体反应,并能抵抗强毒的攻击。

(三)表位疫苗

抗原表位又叫做抗原决定簇,是抗原分子中能够与T细胞表面受体(TCR)、B细胞表面受体(BCR)或者抗体分子的抗原结合片段(Fab)发生特异性结合的特殊化学集团,是引起免疫应答的物质基础。表位疫苗是利用基因工程方法体外表达或者人工合成病原微生物的抗原表位,将其作为抗原制成的疫苗。传统的口蹄疫灭活疫苗主要诱导机体产生体液免疫,而表位疫苗能够诱导细胞免疫,并且具有良好的安全性,因此成为口蹄疫疫苗研究中的一个新热点。

研制表位疫苗的前提是筛选出所需的抗原表位。过去使用蛋白质降解法确定抗原表位,但这种技术非常繁琐,而且只能获得线性表位而无法获得构象表位。近几年随着分子生物学技术的发展,开始使用噬菌体展示肽库技术分析抗原表位,这种技术可以同时分析线性表位和构象表位。另外还有一种使用生物信息学软件分析口蹄疫病毒基因组并预测所有可能的抗原表位,再通过实验验证的方法,实践表明这种方法能够比较精确的找到T细胞抗原表位。

表位疫苗的抗原只是一段氨基酸残基,免疫原性很差而且容易被机体降解,必须与一定的载体连接才能制备疫苗。脂质体是常用的表位疫苗载体,将抗原与脂质体连接能够增大抗原的体积,帮助其被抗原递呈细胞识别。脂质体还具有缓释剂和佐剂的作用,可以使抗原在体内稳定长期存在并缓慢释放的同时增强免疫应答。蛋白载体也常常作为表位疫苗的载体使用。乙肝病毒的核心蛋白能够允许抗原插入其中,并能够将外源表位肽暴露于蛋白颗粒表面,因此是常见的蛋白载体。热休克蛋白也可以作为蛋白载体使用。

Bittle等合成了口蹄疫病毒O1K株VP1上的7个短肽,将其分别与KLH蛋白偶联后免疫兔子和豚鼠,结果VP1蛋白141~160位及200~213位的短肽引起机体产生较强免疫应答,从此开启了口蹄疫表位疫苗研究的序幕。理论上讲,连续的重复性表位肽能诱导更强的免疫应答,Zamorano等将口蹄疫病毒VP1蛋白135~144、135~160短肽制成多聚体后免疫动物均能诱导机体产生高效价的中和抗体。吴绍强等利用生物信息学软件分析了SATⅡ型FMDV可能的抗原表位,并人工合成了8条表位肽,与载体蛋白偶联后免疫接种小鼠,检测结果表明其中的6条多肽免疫小鼠后能产生抗体。Wang等发现AsiaI型口蹄疫病毒VP1抗原表位第133~163位氨基酸寡肽具有良好的免疫原性,而用VP2蛋白的第1-33位氨基酸寡肽单独免疫不能诱导有效的免疫答, 但能明显加强VP1表位短肽的免疫原性。该研究表明要研制良好的口蹄疫表位疫苗, 除考虑抗原表位外, 还要寻找与其他结构蛋白和非结构蛋白表位的联合, 这可能有助于开发免疫原性更强的表位疫苗。Du等用腺病毒表达体系分别表达了口蹄疫病毒VP1第21~60位、141~160位和200~213位氨基酸串联多表位重组蛋白, 猪α干扰素和猪α-干扰素偶联口蹄疫多表位重组蛋白抗原三种蛋白, 并分别免疫豚鼠和猪,结果显示猪α-干扰素偶联口蹄疫多表位重组蛋白引起体液免疫和细胞免疫的能力最强, 用同源病毒攻击被免疫动物, 获得100%保护。杨亮等选取牛O型口蹄疫病毒VP1蛋白上的B细胞表位和T细胞表位,将用多种排列方式连接组合,利用计算机预测蛋白质的3维结构,选取其中最优的结构进行构建。经大肠杆菌表达重组蛋白后免疫豚鼠后,在豚鼠体内诱生了高水平的抗牛O型口蹄疫病毒的抗体。常惠芸和邵军军等利用基因操作、蛋白质表达等相关技术研制了针对猪、牛和羊的口蹄疫病毒多表位重组疫苗,该疫苗无论是在实验动物还是本动物不仅能够诱导机体产生高水平的保护性中和抗体,而且能够诱导淋巴细胞发生增殖反应,具有良好的免疫效果。其中研制的猪O型口蹄疫广谱多表位疫苗能够保护猪只抵抗目前国内流行的三个谱系毒株的攻击,100%保护。牛的Asia1单价疫苗和Asia1/O型联苗能够保护免疫豚鼠抵抗同源病毒的攻击。羊Asia1型口蹄疫多表位疫苗对本动物羊进行加强免疫后产生了高水平的保护性中和抗体。曹轶梅和卢曾军等用3个不同谱系O型口蹄疫病毒B细胞表位和通用性T细胞表位串联表达,加入聚肌胞佐剂,使免疫猪显著提高了保护不同谱系强毒攻击的水平。

(四)病毒活载体疫苗

病毒活载体疫苗是将抗原基因插入载体病毒的特定位置上,然后用载体病毒转染细胞,载体病毒在复制的同时使抗原基因得到表达,将表达产物纯化后制成的疫苗。近年来,活载体病毒在口蹄疫疫苗研发中越来越受到重视,原因是病毒活载体疫苗具有诸多优点,例如:一个载体病毒中可同时插入多个外源基因,表达多种病原微生物的抗原,同时起到预防多种传染病的作用等。口蹄疫病毒有7种血清型,理论上可以将不同型口蹄疫病毒的抗原基因插入到同一活载体中制成多价疫苗。目前用于表达口蹄疫病毒抗原的病毒载体主要有痘病毒、腺病毒、杆状病毒、脊髓灰质炎病毒、牛鼻气管炎病毒、牛瘟病毒及烟草花叶病毒等。下面就几种常见的病毒载体做简要介绍。

痘病毒是第一个用做载体的病毒,也是应用最广泛的载体病毒。痘病毒具有宿主范围广、体外培养可以保持较高滴度、不易丧失感染性、基因组容量大且含多个非必需区等特点,有利于进行基因工程操作,而且插入多个外源基因还能保持抗原性稳定和免疫原性。研究发现重组痘病毒接种豚鼠能同时引发体液免疫和细胞免疫。Berinstein等构建了表达口蹄疫病毒P1基因的重组痘病毒,用此重组痘病毒接种Balb/c小鼠后用ELISA 检测出高滴度的口蹄疫病毒抗体,并能使小鼠获得抗同源病毒攻击的能力。Zheng等用鸡痘病毒作载体构建了表达口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组疫苗,在小鼠和豚鼠免疫试验均表现出较好的免疫效果,并且在豚鼠攻毒试验中,可抵抗同源病毒攻毒。金明兰等将口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A 基因和蛋白酶3C 基因插入鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒,免疫小鼠后,可产生较高水平的特异性抗体。Ma等将口蹄疫病毒的衣壳蛋白P12A 基因、3C编码区基因、猪白细胞介素18基因等导入鸡痘病毒基因组中,免疫动物后,可产生对O型FMDV的部分保护作用。痘病毒能够感染多种动物,在一些体弱动物会引起比较强烈的病理反应,还能通过接触传播,这在一定程度上阻碍了其作为载体的相关研究。2007年,中国农业科学院兰州兽医研究所张强将中国应用广泛的山羊痘疫苗弱毒株(AV41)改造为一个痘病毒载体,表达口蹄疫病毒P1-2A3C基因获得成功,为反刍动物活载体疫苗的研究提供了新的思路。

人腺病毒是表达外源基因的常用载体。腺病毒可在多种细胞上生长,外源蛋白表达量高,另外腺病毒基因以附着体形式长期存在于机体内,在此期间外源基因可以不断地表达,从而延长对机体的免疫刺激,达到更好的免疫效果。Sanz等用人IV型腺病毒疫苗株(Ad5 wt)载体,构建了表达结构蛋白P1基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad5-P1。用Ad5 wt和重组的Ad5-P1混合后经皮下或鼻内接种牛,在第二次免疫后滴鼻感染口蹄疫病毒,牛得到有效的保护。Mayr等构建了表达口蹄疫病毒结构蛋白的VI型腺病毒并制成疫苗,间隔4周用相同剂量免疫猪群两次,可使猪群产生高水平的口蹄疫病毒中和抗体,80%以上免疫猪得到完全保护。Du等将口蹄疫病毒P1基因和猪的干扰素基因同时插入人腺病毒基因中,构建了重组腺病毒,免疫豚鼠后可产生高水平的中和抗体,并可保护豚鼠免受O型口蹄疫病毒的攻击。
杆状病毒(Baculovirus)是昆虫病毒,具有以下主要优点:(1)病毒基因组较大,可以同时表达多个外源基因;(2)杆状病毒不感染动物细胞,因此遗传学上是安全的表达载体;(3)昆虫细胞属于真核细胞,能够对表达产物加工修饰,因此绝大部分外源基因表达产物均有良好的生物活性;(4)启动子强,外源基因可得到较高表达。1993年美国梅岛动物疾病研究中心用杆状病毒表达口蹄疫病毒的P1蛋白及部分P2蛋白和P3蛋白,免疫猪群后能使部分猪获得抗强毒攻击保护力。2008年,柳纪省等用家蚕杆状病毒表达体系表达了口蹄疫病毒Asia1型空衣壳抗原,家蚕杆状病毒载体在蚕体内复制时表达的口蹄疫病毒抗原蛋白经过修饰,在理化性质和免疫学活性等方面与口蹄疫病毒粒子的衣壳蛋白相似。用这种杆状病毒去掉核酸制成的空衣壳没有感染性,但可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应,是理想的制苗抗原。

(五)核酸疫苗

核酸疫苗也称基因疫苗,是把外源的抗原基因克隆到质粒上,然后将此质粒转入动物体内,使外源基因在动物体内表达产生蛋白抗原,诱导机体产生免疫反应的疫苗。从理论上讲核酸疫苗成本低、免疫期长,又易于设计和构建,因此被称为免疫学上的第三次革命。最初构建的口蹄疫核酸疫苗是包含A12株cDNA全基因组的pWRM质粒,但全基因组在表达时有可能会产生活病毒,因此在之后的研究中通常只构建表达抗原表位的核酸疫苗,而最常表达的抗原表位仍旧是衣壳蛋白VP1上的140~160及200~213氨基酸序列,但实践证明这些表位引发的免疫反应很弱。之后学者们开始把衣壳蛋白编码区基因与非编码区基因共同构建同一质粒,以期产生更强的免疫反应。Benvenisti将口蹄疫病毒完整的衣壳蛋白基因P1和非结构蛋白基因2A、3CD 串联起来,同时加入心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES),构建核酸疫苗并注射到猪皮肤中,部分猪可以抵抗口蹄疫病毒强毒的攻击。Shieh 等为增强免疫效果将核酸疫苗和亚单位疫苗联合使用,具体方法是首先用含有口蹄疫病毒VP1基因的质粒免疫小鼠,再用VP1蛋白抗原二疫,小鼠产生了高效价的中和抗体。因IgG在宿主体内有较长的生命周期,与IgG分子融合能够延长VP1抗原的半衰期,理论上能使宿主持续受到刺激,引发更强烈的免疫反应,Wong 等分别构建了两种编码口蹄疫病毒VP1两个抗原位点141~160、200~213氨基酸序列及猪、小鼠免疫球蛋白IgG恒定区的质粒。用这两种质粒分别免疫猪和小鼠,在小鼠同时引发了体液免疫和细胞免疫,猪获得了抗强毒攻击的保护力。

(六)基因缺失疫苗

基因工程技术的发展,使得人为突变病毒基因组或删除病毒某一蛋白编码区成为现实,因此基因缺失疫苗应运而生。基因缺失疫苗是使用基因工程技术把病毒强毒株中与毒力相关的基因切除,使其成为弱毒或者无毒的毒株,然后制成的活疫苗。基因缺失疫苗具有安全性好、毒力不易反强、注射疫苗后机体产生的免疫应答与强毒感染几乎完全一致等诸多优点而得到很多学者的重视。另外还可将切除的毒力基因表达后制成诊断试剂,从而区分免疫动物和自然感染动物。

McKenna等使用基因工程技术获得了一株删除VP1基因上的RGD受体结合位点的口蹄疫病毒A12,将此毒株接种猪和乳鼠都不致病,接种牛不会引发任何症状,但可以产生高水平的中和抗体,并对病毒攻击能产生保护力。Chinsangaram 等构建了一株L蛋白酶基因缺失的A12 型口蹄疫病毒,该毒株可以在BHK-21细胞中正常增殖,在接种乳鼠之后无明显症状而且不会在个体间传播,接种牛和猪能快速引发免疫反应,而且产生的保护力与灭活疫苗相似。这一毒株的L蛋白酶基因缺失使其毒力反强的可能性大大下降,而又具有无毒力并且不会在动物间传播的特性,所以不论做灭活疫苗或者活疫苗都很适合。

(七)标记疫苗

口蹄疫灭活疫苗免疫后动物经常出现隐形感染和持续带毒的情况,一般认为灭活疫苗中除去了绝大多数非结构蛋白,免疫动物几乎不产生非结构蛋白抗体,而感染动物体内具有非结构蛋白抗体。因此经常使用检测血清中非结构蛋白抗体的方法区分疫苗免疫动物中的感染动物。新型疫苗出现后面临着与灭活疫苗同样的问题,为了便于在实验室诊断中能够区分疫苗免疫动物和感染动物,近年来出现了一些能够进行鉴别诊断的标记疫苗。口蹄疫标记疫苗,是缺失了病毒某段致病相关基因或优势表位基因的弱毒苗或灭活苗。该类疫苗保持了弱毒苗或灭活苗免疫效力最优的特性,且消除了常规疫苗多次免疫干扰鉴别诊断缺陷。利用反向遗传操作技术,即可有目的的缺失基因,构建标记病毒,同时也可修饰抗原表位基因,拓展病毒抗原谱。在研发标记疫苗的同时,也要研发相应的鉴别诊断技术。只有鉴别诊断成熟的新型疫苗才能叫做标记疫苗。刘在新等已完成口蹄疫O型标记灭活疫苗的实验室研究,进入了临床试验阶段。

理论上讲新型疫苗都能够开发成为标记疫苗,关键的问题是如何选择与之配合的鉴别诊断技术。常用的鉴别诊断技术有很多种,与口蹄疫标记疫苗相配合的诊断技术主要有基于单克隆抗体和重组抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因芯片(Gene Chip)技术和生物传感技术。ELISA通过检验疫苗中独特的蛋白标记物的特异性抗体来做鉴别诊断。而RT-PCR技术通过扩增并直接检测口蹄疫病毒的基因来做鉴别诊断。基因芯片(Gene Chip)是分子生物学与电子芯片融合的技术,首先设计与被检测基因序列互补的探针, 并将其固定于固相载体(如硅片、玻璃、塑料等)表面形成阵列,与被检测物发生反应后将信号传导给计算机,通过专用软件分析可快速、准确地做出诊断。基因芯片技术具有快速、微量、准确等优点,已逐渐发展成为新型诊断方法。生物传感技术是将特异性抗体等与口蹄疫相关的生物学作用转换为可测量信号,然后对这种信号进行检测的技术。信号转换技术包括电化学测定法、反射测定法、干扰测定法、共振测定法及荧光测定法等。由于设备成本高、单个样品分析昂贵,并且需要经专业培训的人员来进行操作,因此生物传感技术目前仅用于科研方面。

(八)病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有病毒的核酸,不能自主复制,没有感染性,其结构与病毒相似,可以通过与病毒相同的途径传递给免疫细胞,并有效的诱导机体产生免疫保护反应。随着基因工程技术的发展,多数病毒衣壳蛋白基因都已经能够在表达系统中有效表达并自我组装,这为病毒样颗粒疫苗的研发提供了便利条件。病毒样颗粒在人用疫苗的研究非常广泛,并已有商品疫苗投入市场,但在兽用疫苗领域开始相关研究的时间较短。口蹄疫病毒样颗粒的研究方面,孙世琪等用大肠杆菌原核表达系统表达了口蹄疫衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1在体外组装出嵌合型FLAG外源多肽口蹄疫病毒样颗粒,外源蛋白的插入没有影响病毒样颗粒的空间结构,这项研究为口蹄疫病毒样颗粒疫苗的研发奠定了基础。郭慧琛等利用泛素化原核系统,研制的VLPs疫苗效力与灭活苗相当,达到了OIE和中国的口蹄疫疫苗要求标准。周国辉等将Asia1型口蹄疫病毒的Asia1/YS/CHA/05毒株的感染性cDNA序列在体外拼接亚基因组,然后将其克隆入人缺损腺病毒5型,病毒在复制的过程中能够形成口蹄疫病毒样颗粒并在病毒传代过程中稳定表达。用这种表达Asia1型口蹄疫病毒样颗粒的重组腺病毒免疫小鼠,可诱导高水平中和抗体,并能持续较长时间。口蹄疫病毒样颗粒具有活病毒的很多免疫学活性,但是没有感染性,稳定性好,不易失活,因此口蹄疫病毒样颗粒疫苗具有关阔的发展前景。

(九)反向遗传疫苗

近年来反向遗传学技术为研究病毒的基因结构与功能,病毒复制与表达调控机理等提供了有效的方法,与此同时,也为反向遗传疫苗的研究开创了一片新天地。反向遗传疫苗是通过反向遗传技术实现对病毒基因的改造和修饰,获得预期生物特性的毒株,以提高生产性能、抗原匹配性、免疫应答能力和生物安全性等特征,用这种毒株制备的疫苗。Fowler等将O1BFS和C3RES的VP1 G-H的130~157位点替换A12毒株相应位点,并制备了单价疫苗,动物实验显示该疫苗能够对牛和猪后发现等抵抗强度强毒攻击。郑海学等用反向遗传操作技术构建疫苗种毒Re-A/WH/09株及成功研制疫苗,解决了田间毒株产量低、抗原不稳定不适作为种毒的难题,将Re-A/WH/09与Asia1型和O型疫苗种毒组合,研制出口蹄疫三价灭活疫苗。该疫苗对各流行毒的PD50均≥9.0,高于OIE推荐的常规疫苗≥3个PD50、紧急免疫接种疫苗≥6个PD50的国际标准。李平花等以O/HN/93疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。该嵌合病毒的成功拯救为口蹄疫嵌合疫苗的研制奠定了基础。Segundo等利用反向遗传技术构建的Sap突变株表现对BHK-21细胞较高的滴度,而对猪没有临床症状、无血毒症和无排毒等现象,而且SAP突变株接种动物引起较强的中和抗体反应,并能够产生早期免疫的全保护,具有发展为无致病疫苗株的潜力。Belinda Blignaut等通过在SAT1型病毒株KNP/196/91的感染性cDNA克隆中编码外部衣壳蛋白的区域(1B-1D/2A)替换SAT2型疫苗株ZIM/7/83相应位点,构建了型交叉的嵌合病毒,将亲本毒和嵌合毒制备的疫苗分别接种豚鼠后诱导产生相似的抗体反应,之后又用该嵌合病毒接种猪后也能够产生中和抗体并能抵抗同源病毒的攻击。反向遗传技术虽然有诸多优点,为新疫苗的研发开辟了一条新途径,但也应看到这种研究存在的生物安全风险,研究人员在实验设计中应当考虑到如何避免病毒毒力返强的问题。

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总结与展望

基因工程技术的发展为新型疫苗研发提供了思路,目前正在研发的新型疫苗有很多种,本文介绍的都是近几年研究较多而且有一定应用前景的新型疫苗。新型疫苗相比灭活疫苗在安全性上更有优势,可根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗,而且大幅度降低生产成本等优点,因此是未来发展的方向。但新型疫苗在免疫效果方面往往不够理想,原因是新型疫苗普遍存在抗原位点少、抗原纯度高或者抗原分子量小等问题,因此常常不能诱导较强的免疫应答。随着生物工程技术的进一步发展,新型疫苗存在的这些问题必将会一一得到解决,相信新型疫苗在未来会取得重大突破。(李冬,刘在新)

*此章节内容摘录来源于动物疫病防控出版工程丛书《口蹄疫》,读者朋友若购买此书及了解其他相关信息欢迎登陆中国农业出版社网站www.ccap.com.cn


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