禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书

兽用

【兽药名称】

通用名　禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清

商品名　无

英文名　AvianInfluenza VirusH5 Subtype（Strain Re-11）HemagglutinationInhibition Test Antigen,Positive Sera and Negative Sera

汉语拼音　QinliuganbingduH5 Yaxing （Re-11 zhu）XueningyizhishiyanKangyuan，Yangxingxueqing Yu Yinxingxueqing

【主要成分与含量】抗原为灭活的H5亚型（Re-11株，2.3.4.4d分支）禽流感病毒，血凝（HA）效价不低于1∶128。测定鸡血清时，使用鸡禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清，血凝抑制（HI）抗体效价不低于1∶128；使用鸡禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1∶4。测定鸭血清时，使用鸭禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清， HI抗体效价不低于1∶160；使用鸭禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1∶10。测定鹅血清时，使用鹅禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清， HI抗体效价不低于1∶160；使用鹅禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1∶10。

【性状】　抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】　用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）抗体。

【用法与判定】 

1  材料

1.1  96孔V型(90度)微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。

1.2  pH值7.0~7.2，0.01mol/L的PBS  按照如下方法配制或购买商品化产品，PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。PBS 配制方法：秤量NaCl 80g、KCl 2g 、十二水磷酸氢二钠 36.3g、磷酸二氢钾 2.4g，溶解于ddH₂O中，并定容至10L，用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0~7.2，最后121℃灭菌30分钟或过滤后使用。

1.3  阿氏（Alsevers）液  称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。

1.4  1%鸡红细胞悬液　采取2~4只 2~6月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS（0.01mol/L，pH值7.0~7.2，下同）洗涤3~4次，每次以1500r/min离心5~10分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。

1.5  抗原溶解  冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。

2　操作术式

2.1  血凝（HA）试验

2.1.1  在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。

2.1.2  第l孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。

2.1.3  从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。

2.1.4  每孔加0.025ml PBS。

2.1.5  每孔加入0.025ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液。

2.1.6  结果判定  将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温20~30分钟或置2~8℃45~60分钟，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

2.2  血凝抑制（HI）试验（鸭、鹅血清在检测血清时需要进行前处理，参考方法见注意事项）

2.2.1  根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1∶1024（举例），4个血凝单位（即4 HAU）=1024/4=256（即1∶256）。取PBS 9.0ml，加抗原 1.0ml，即成1∶10稀释，将1∶10稀释液 1.0ml加入到 24.6 ml PBS中，使最终浓度为1∶256。

2.2.2  四个单位血凝单位检测  检查4 HAU的血凝价是否准确，应将配制的1∶256稀释液进行系列稀释，使最终稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟，如果配制的抗原液为4 HAU，则1∶4稀释度将给出凝集终点；如果4 HAU高于4个单位，可能1∶5或1∶6为终点；如果较低，可能1∶2或1∶3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4 HAU。

2.2.3  第2～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。

2.2.4  第1、2孔加入0.025ml血清；第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔，依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。

2.2.5  第1～11孔均加入0.025ml的4HAU抗原，在室温（20～25℃）下静置至少20分钟或2～8℃ 至少60分钟。

2.2.6  每孔加入0.025ml 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20～40分钟或2～8℃ 40～60分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。

3  结果判定  以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。检测鸡血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1∶4时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1∶8判为阴性，不低于1∶16判为阳性。检测鸭和鹅血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于1∶10时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1∶10判为阴性，高于1∶10（不含1∶10）判为阳性。

【注意事项】  （1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。

（2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。

（3）用pH值7.0～7.2的PBS（0.01mol/L）作为稀释液。

（4）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。

（5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。

（6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超过1个月。

（7）同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI抗体效价不同。

（8）鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。

①胰酶-加热-高碘酸盐法

A.取0.3ml血清，加0.15ml胰酶溶液（8mg/ml：200mg的P-250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L, pH值7.0∼7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，分装并在 −15℃以下保存，保存期6个月），混匀后，在56℃水浴灭活30分钟后冷却至室温。

B.再加入0.9ml高碘酸钾（将230mg的KIO4用0.01mol/L, pH值7.0∼7.2的PBS，定容至100ml，过滤除菌后避光室温保存，保存期1周），混合，室温孵育15分钟。

C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液（1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值 7.0∼7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15分钟。

D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4℃保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。

②受体破坏酶（RDE）处理法

A.1体积血清（50μl），加4体积RDE（200μl），37℃水浴18小时（过夜）。

B.再加入5体积（250μl）的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56℃水浴30分钟（以破坏残余的RDE活性） 。

C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中（50μl红细胞+500μl血清），震荡混匀后4℃放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。

D.1000g离心10min，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。

【规格】  （1）1ml/瓶  （2）2ml/瓶

【包装】　（1）10瓶/盒  （2）24盒/箱  （3）60盒/箱

【贮藏与有效期】−15℃以下保存，有效期为24个月。

【批准文号】

【生产企业】