从发病猪群中分离培养病原是所有传染病诊断的黄金标准，猪支原体肺炎的诊断也不例外。因M.hyo生长营养要求高，早期的病原培养主要采用原代肺脏组织块进行，即使开发出人工培养基也需要添加无抗体的猪血清来提高效率，增加了操作难度和成本。菌种分离、接种成功后，在培养基中繁殖到可供检测评估的含量需要4～8周的时间，限制了该方法的临床使用。支原体属在环境和健康猪体中还存在大量不致病的猪絮状支原体和致关节炎等疾病的猪滑液支原体，在分离培养过程中，这些不相关支原体的存在会与M.hyo竞争营养，严重降低分离成功率。综上所述，传统的病原分离培养虽然是疾病诊断的黄金标准，但对于猪支原体肺炎的诊断而言，病原分离培养技术并不适合临床诊断用。对于耐药性研究、疫苗种毒选育和不同毒株致病机理等长期投入的研究是不可或缺的。生产实践中分离田间野毒株，加强后备母猪的驯化，在获得纯化的毒株后也更容易落实。

PCR检测技术是常用的微量、快速、灵敏度高、特异性强的病原检测方法。在针对M.hyo的检测中，为了区分同源性高的支原体属病原的干扰还可以设计巢式PCR检测，准确率更高。采样部位的选择对M.hyo阳性猪只的检测灵敏度也很重要，研究证实鼻拭子的检测准确率低于气管拭子，更低于气管支气管灌洗液的检测准确率。但后两者采样要求高，在一定程度上限制了这类方法的推广使用。PCR检测克服了病原分离培养的弊端，虽然成本偏高也不太适用于大规模检测评估，但在获取相对准确的流行病学数据方面更快更可靠。

Pieters通过给易感猪只攻毒，采用PCR技术检测猪只气管M.hyo的带毒情况，跟踪攻毒猪只的排毒时间证实，所有攻毒猪只在攻毒94d后PCR检测M.hyo的核酸100%阳性，攻毒214d后猪只PCR检测阳性率下降为61%，攻毒254d后所有猪只气管已经检测不到M.hyo核酸，这表明自然感染M.hyo野毒的猪只个体可维持带毒排毒至少254d。继而跟踪监测与攻毒猪只混养的哨兵猪只的气管带毒情况，发现在感染后8～200d的时间里，攻毒猪只都可以向体外排毒，感染其他易感猪只，这为生产过程中对后备猪群采取M.hyo的驯化并建立阴性猪群提供了理论依据。将引入的所有后备母猪人为暴露于M.hyo野毒阳性环境里，确认所有猪只感染后闭群管理，在分娩前254d时间里保持不再接触其他毒株，分娩后便可以获得M.hyo阴性的仔猪。

Giacomini通过跟踪PCR跟踪监测意大利66个牧场，不同生产模式下猪群M.hyo的气管拭子病原检测阳性率，发现猪群中M.hyo的感染状态主要受猪群猪只日龄和生产模式的影响。相同生产模式下日龄越大，猪气管拭子中M.hyo的核酸检出率越高；不同生产模式下，单点式生产比多点式生产的猪只气管拭子中M.hyo核酸的检出率高；而且单点式生产模式相比多点式生产更容易发生早期感染，病原的传播流行速度也相对更快。说明M.hyo在猪群中的传播主要依靠不同日龄猪只的接触和易感猪群间的水平传播进行。

更多的研究则通过PCR检测技术调查区域内M.hyo的流行情况，如Pacce通过屠宰场内肺脏采样监测发现巴西国内M.hyo的检出率高达90%以上；而Vicente通过屠宰场血清阳性率调查得出数据只有52%。这也反映出PCR检测相对血清抗体检测而言有更高的准确性。

M.hyo疫苗的免疫可以减轻感染引起的临床症状、降低疾病造成的经济损失，但不能阻止野毒继续感染，通过PCR检测野毒阳性率评估疫苗免疫的效果并不是一个好选择。

只由M.hyo感染引起的慢性呼吸道病以非连续性的干咳为主，猪只体温不会升高，引起的肺部病变在3个月左右可以自行吸收恢复，但通常会留有疤痕，死亡率不高。当猪只表现出发烧、腹式呼吸时则表示出现了继发或混合感染，地方流行性肺炎和呼吸道疾病综合征都可出现更严重的临床症状，最终导致高死亡率。剖检诊断通常针对死亡不久或濒死没有饲养价值的猪只，M.hyo感染造成的肺部病变很典型，病原感染引起的炎症反应及淋巴细胞的挤压、凋亡等会导致肺尖叶、心叶甚至膈叶出现对称性的肉样变，与正常肺组织界限明显，触摸无气胀感。临床症状和剖检诊断是疾病诊断的第一步，依据典型病变可以判定猪群在特定阶段存在M.hyo感染，但致死的主要原因还要结合其他病变的诊断和后续的检测进行确认。因小日龄猪只肺部病变还存在再吸收的可能，所以育肥猪和到屠宰上市猪只肺部肉样变更能反映猪群真实的支原体病变情况。

剖检过程中肺部尖叶、心叶之间注意是否有纤维丝状粘连，即使没有看到典型肉样变，出现这类粘连表明支原体的早期感染，病变在积蓄形成中。对于保育猪只的临床剖检特别要留意这种现象。

血清学诊断技术是一种比较好的针对群体采样、评估疾病感染及免疫应答效率的方法。

目前在售的有多款对M.hyo的抗体检测试剂盒。但血清学诊断是基于体液免疫应答的抗原抗体反应，M.hyo感染定植在呼吸道，极少进入血液、淋巴循环系统，即使刺激机体产生了抗体，体液中的高水平抗体也无法接触到病原产生中和作用。所以ELISA检测试剂盒检测到的抗体水平无法反应疫苗免疫的保护效果。但作为未免疫猪群血清流行病学调查可以提供参考，其准确率低于PCR检测，但不失为一种成本低、数据量大的调查方法。

M.hyo的基因组含有近700个开放阅读框，232毒株在体外培养时实际表达的蛋白约480种， 由于毒株差异、疫苗培养工艺不同，M.hyo全菌灭活苗会存在抗原表达丰度的差异。以对M.hyo定植有重要作用的膜表面蛋白为例，目前已知的定植膜蛋白种类有35种，很难通过几种蛋白的组合免疫就能起到良好的免疫效果，全菌疫苗由于抗原表达丰度的差异也不一定面面俱到地刺激产生不同蛋白的抗体。生产实践中，通过同一种试剂盒检测不同M.hyo疫苗免疫4周后的抗体阳性率在30%～100%之间。寻找更加保守的蛋白靶标，通过灵敏度更高的ELISA方法可以缩小这种差异，为疫苗免疫效率评估提供指导。

可采用标记抗体对在气管、支气管等组织切片上的M.hyo病原进行检测，M.hyo很少造成致死性病变，临床诊断并不困难，生产实践中很少使用。

在评估疑似PCV2造成病变时，需要结合组织病理学诊断技术进行确诊。现代养猪生产中，PCV2病毒广泛存在，疫苗免疫猪群也经常能检测到PCV2病毒血症。但确诊疾病是否由PCV2病毒感染引起，组织病理学检测最具指导价值。同样都会引起猪群免疫抑制，PRRSV感染和PCV2感染引起的免疫抑制是截然不同的。在PCV2疫苗普遍免疫的情况下，断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）依然在一些猪场出现，很多情况下是PRRSV活跃引起。在评估PCV2疫苗及圆支二联疫苗免疫效果时需特别注意。

屠宰场肺部病变评分是对正常屠宰上市猪只进行肺部病变评分，主要评估猪群M.hyo感染和传染性胸膜肺炎感染状况的方法，其中M.hyo感染引起的肺部病变评分有28分制、5分制、55分制、35分制等，其中以Madec 28分制操作简便、易于操作使用最为广泛。因屠宰上市的猪只数量大、支原体肺部病变特征明显，操作成本低且可以重复进行，是猪群呼吸道疾病调查和猪肺炎支原体疫苗评估必不可少的工具。前文提到的临床诊断和剖检仅针对少量发病猪，并不具有代表性。以屠宰场传染性胸膜肺炎病变比例为例，超过2%的肺脏有典型病变时，全群就需要采取治疗和免疫措施。对PRDC几种主要病原疫苗免疫效果的评估更需要落实到屠宰场进行肺部病变评估。单纯的免疫应答指标仅反映疾病发展中的一个暂时状态，免疫应答是否造成器质性损伤引发病变是一个级联反映的结果。Thacker发现PRRSV弱毒疫苗免疫能提升M.hyo疫苗的抗体，但在验证支原体攻毒保护时PRRSV疫苗的免疫却导致了M.hyo疫苗对肺部病变保护效果的下降。非洲猪瘟疫情过后，层出不穷的联合免疫方案应运而生，在评估联合免疫的可行性方案时，很多实验只关注了抗体应答指标，忽视了细胞免疫和机体炎症反应引起的实质病变评估。