猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法
1 适用范围
1.1猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。
1.2猪源毒种。
1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。
1.4其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。
2 取样和处理
2.1 疫苗
2.1.1 活疫苗 取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.1.2 灭活疫苗 取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。
2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗 取36 ml混合疫苗，加入正戊醇4.0 ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。
2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗
2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗 取混合疫苗5.0 ml，摇匀，加入0.25 g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时，5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗 直接取混合样品进行核酸提取。
2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.3 猪源毒种 取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
2.4 猪源细胞 除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。
2.5 其他猪源原辅材料
2.5.1猪组织 每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0 g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.5.2猪血清 每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.5.3猪胰酶 干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.5.4其他猪源衍生物 固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。
3 核酸提取
3.1 试剂和器材
3.1.1试剂 根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。
3.1.2仪器 核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10 µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。
3.1.3耗材 1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。
3.2 操作程序（TRIZOL法），也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。
3.2.1取样品250 µl，加入750 µlTrizol，颠倒混匀，室温放置5分钟。
3.2.2加入200 µl氯仿，充分混匀，室温放置10 分钟，4℃下以12000 g离心15 分钟。
3.2.3弃去上清液，加入220 µl无水乙醇，颠倒混合，15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟，沉淀物为DNA。
3.2.4弃去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 µl洗涤DNA，15～30℃放置30分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟。重复一次。
3.2.5加入75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉淀，15～30℃放置20分钟，4℃2000 g离心5分钟。可重复一次，充分洗涤DNA沉淀。
3.2.6弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA，－20℃以下保存备用。
3.3 注意事项
3.3.1核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。
3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。
3.3.3为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。
3.3.4做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。
3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。
4 检测
下列两种方法可任选其一。
4.1 实时荧光定量PCR检测法
4.1.1试剂和器材
4.1.1.1 试剂
4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂 本操作中以AppliedBiosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。
4.1.1.1.2 扩增引物及探针扩增引物：
ASF-05-Zsak-1466F（10µmol/L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'
ASF-05-Zsak-1528R（10µmol/L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'
探针ASF-05-Zsak-1486prob(10µmol/L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'
4.1.1.1.3 无核酸酶的灭菌水 PCR级别。
4.1.1.2 仪器 荧光定量PCR仪；微量移液器1套（最大量程分别为10µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。
4.1.1.3 耗材 1.5ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。
4.1.2 操作程序
4.1.2.1 样品DNA制备 按照前述方法进行核酸提取。
4.1.2.2 反应体系的配制 配制比样品数量至少多4个的反应体系，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中分别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 µl，在阴性对照反应管中加入3µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：
成分 | 体积（µl） |
2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix | 10 |
ASF-05-Zsak-1466F（10 µmol/ L） | 1 |
ASF-05-Zsak-1528R（10 µmol/ L） | 1 |
探针(10 µmol/ L) | 0.8 |
DNA | 3 |
无核酸酶灭菌水 | 4.2 |
| 总量20 |
4.1.2.3 反应程序 将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟，95℃15秒，58℃退火延伸1分钟，45个循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行）。
4.1.2.4 结果判定
4.1.2.4.1 阈值设定 试验操作结束后，确定Ct值。Ct值为每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。
4.1.2.4.2 质控标准
对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：
阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线。
强阳性对照的Ct 值应在18～22之间，并出现典型的扩增曲线。弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线。
4.1.2.4.3 判定
阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。
阳性：Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。
可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。重检后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，其他情况均判定为阴性。
4.2 普通 PCR检测法
4.2.1 试剂和器材
4.2.1.1 试剂
4.2.1.1.1 PCR试剂 10×PCR缓冲液（含25 mmol/l Mg2+），DNA扩增酶，dNTP预混液。
4.2.1.1.2扩增引物
primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；
primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。
4.2.1.1.3 DNA分子量标准品 DL500。
4.2.1.1.4 TAE电泳缓冲液 配制方法见《电泳液标准配制流程》。
4.2.1.1.5 1%琼脂糖凝胶板 在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
4.2.1.2 仪器 DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。
4.2.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、0.2ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）。
4.2.2操作程序
4.2.2.1 样品DNA制备 按照前述方法进行核酸提取。
4.2.2.2 反应体系的配制 配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 µl，在阴性对照反应管中加入2.0µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：
成分
| 体积（µl） |
10×PCR缓冲液 | 2 |
DNA 扩增酶 | 1 |
dNTP | 0.5 |
PPA-1 (10 μmol/L) | 1 |
PPA-2 (10 μmol/L) | 1 |
DNA | 2 |
无核酸酶灭菌水 | 12.5 |
| 总量20 |
4.2.2.3 反应程序 将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：94℃2分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。4℃保存。
4.2.2.4 PCR扩增产物分析 取PCR扩增产物10 µl，加6×加样缓冲液2.0 µl，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳时间30分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统拍照，记录检测结果。
4.2.2.5 结果判定
4.2.2.5.1 质控标准
对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：
阴性对照应不出现257bp的特异性条带。
阳性对照应出现257bp的特异性条带。
4.2.2.5.2 判定
阳性：待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。
阴性：待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
4.3 注意事项
4.3.1检测过程中应遵循PCR实验分区原则，即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。
4.3.2应避免在含有靶序列的区域中使用引物，防止污染靶序列。
