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我国家禽H7N9和H9N2亚型流感流行病学调查

日期:2018-12-06 15:47:48

禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒引  起的禽类传染病 。近年来,H9N2 亚型和 H7N9  亚型流感病毒在我国家禽中引起较为严重的疫情,  H7N9 亚型病毒在我国还引起较多的人间感染病例  。为有效了解 H9N2 亚型和 H7N9 亚型流感  的流行态势、疫情风险以及病毒变异情况,2018  年 3—5 月,在上海、江苏等 11 个省市,开展了  H9N2 和 H7N9 亚型流感流行病学调查。

  1 材料与方法 

 1.1 主要试剂与耗材  QIAxtractor高通量核酸提取仪配套相关试剂、  QIAxcel Advanced 全自动毛细管电泳分析仪配套  试剂:购自 QIAgen 公司;HiScript II One Step RTPCR  Kit:购自 Vazyme 公司;植绒拭子:购自深圳麦瑞科林科技有限公司。

1.2 样品采集

2018 年 3—5 月,在上海、江苏、湖北、江西、广东、广西、云南、贵州、西藏、宁夏、黑龙江等11 个省份,随机选择 17 个活禽批发市场、37 个活禽零售市场、11 个养禽场、1 个散养户、1 个屠宰场,共 67 个场点,随机采集 4 792 份样品(每份样品含 1 只禽的咽肛双拭子样品),其中鸡 3 736 份、鸭 703 份、鹅 131 份、鸽 222 份,置于加有抗生素(259 mg/L 庆大霉素、60 mg/L 左旋氧氟沙星、60 mg/L 阿奇霉素)的 PBS- 甘油采样液中(pH7.2~7.6)保存,在 4 ℃下运输和保存。

1.3 RNA 提取

将采集的样品 10 000 r/min 离心 10 min,取上清液,用 QIAxtractor 高通量核酸提取工作站提取病毒 RNA,−70 ℃保存备用。

1.4 HA 和 NA 基因扩增

按农业行业标准(NY/T772-2013),用 HiScriptII One Step RT-PCR Kit,对流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因进行 RT-PCR 检测。引物序列见表 1。

RT-PCR 扩增反应体系为 25 μL,包括 2×RT-PCRBuffer 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μL,Enzyme Mix 1.25 μL、ddH2O 6.25 μL、RNA 模板3.0 μL。RT-PCR 反应条件为:50 ℃反转录 30 min,94 ℃预变性 5 min,然后进行 35 个循环(94 ℃变性30 s,57 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 2 min),最后 72 ℃延伸 7 min。按照 QIAxcel 全自动毛细管电泳仪操作步骤,将 RT-PCR 的产物进行电泳检测,将阳性样品送至青岛睿博兴科生物技术公司测序。


1.5 序列分析

利用 MAGE 5.0 软件中的 Clustal W 方法,将本试验中检测到的病毒 HA 基因序列与参考株基因序列进行比对,再选择部分序列进行谱系分析。谱系分析的参数设置如下:采用Neighbor-joining计算方法,核苷酸变异设为 Kimura 2-parameter 模式,各位点变异速率设为 Gamma 分布(α=1.0)。Bootstrap 值的计算设置为 1 000 个重复。

1.6 显著性检验

对本次调查的阳性率,按照卡方检验进行显著性分析,P<0.05 判为差异显著。

2 结果与分析

2.1 H7N9 病毒检测

在 4 792 份样品中,未检出 H7N9 亚型病毒。

2.2 H9N2 病毒检测

2.2.1 宿主分布 在 4 792 份样品中,检测出H9N2 亚型病毒 1 208 份,样品总阳性率为 32.34%(1 208/4 792),场点总阳性率为 80.60%(54/67)。其中,鸡样品阳性率为 29.18%(1 090/3 736),鸭 为 12.23%(86/703), 鹅 为 1.53%(2/131),鸽为 13.51%(30/22)。鸡样品 H9N2 亚型阳性率显著高于其他宿主样品(P<0.05,图 1)。


图 1 各宿主样品 H9N2 亚型病毒阳性率分布

2.2.2 区域分布 11 个省份中,除黑龙江省外,其余 10 省份均存在 H9N2 亚型病毒感染(图 2),其中江西、贵州、江苏、西藏的样品检出率较高,分别为 54.79%(263/480)、53.54%(257/480)、44.42%(191/430)、40.07%(199/297); 湖北 和 云 南 次 之, 分 别 为 24.20%(98/405) 和21.67%(104/480);宁夏、上海、广东、广西检出率较低,分别为 13.75(66/480)、11.33%(34/300)、10.21%(49/480)、5.63%(27/480)。


图2 各省样品 H9N2 亚型病毒检出率分布

2.2.3 场点分布 活禽批发市场样品阳性率

为 29.70%(605/2 037),场点阳性率为 100%(17/17);活禽零售市场样品阳性率为 27.09%(592/2 185),场点阳性率为 96.40%(35/37);  养禽场样品阳性率为 2.29%(11/480),场点阳  性率为 18.20%(2/11);散养户和屠宰场未检  测到阳性样品(图 3)。活禽市场(含批发和零  售的活禽市场)的场点阳性率为 96.30%,显著  高于其他场点(含养禽场、散养户、屠宰场)的  15.38%(P<0.05)。 


图 3 各类场点 H9N2 亚型病毒阳性率分布

2.2.4 时间分布 本实验室分别于每年的 3—5 月  和 10—12 月,开展两次全国禽流感流行病学调  查(图 4)。结合这些调查监测结果,可以看出  H9N2亚型病毒在我国长期处于较高的流行态势,  上半年的感染率一般比下半年低。这估计是因为  3—5 月的温度高于 10—12 月,不利于病毒传播。  值得注意的是,2018 上半年 H9N2 亚型病毒检出  阳性率显著高于往年同期检测值(P<0.05),达  到近年来最高点,提示当前我国家禽 H9N2 亚型  病毒染风险有进一步增大趋势。 


图 4 2013—2018 年 H9N2 亚型病毒流行变化趋势

 2.3 基因序列分析  本次调查检出的 H9N2 亚型病毒的 HA 蛋白裂  解位点处的氨基酸序列为 PSRSSRGLF,为典型的  低致病性流感病毒分子特征。这些序列第 226 位氨  基酸都为酪氨酸(L),能够结合人样的 α2,6- 唾  液酸受体。选取 39 株代表我国分离到的不同谱系  H9N2 亚型病毒序列和 6 个我国普遍使用疫苗毒株  的 HA 基因序列作为参考序列,在检出的 1 208 株  H9N2 亚型病毒中,随机筛选出 123 条序列与参考  序列进行对比和遗传进化分析,发现检出的毒株均  属于 h9.4.2.5 分支。该分支为 2007 年以来我国 H9  亚型病毒主要流行分支,未表现出明显的地域性差  异。检出的部分离株 HA 基因的遗传进化树见图 5。 

 3 讨论  本次调查未检出 H7N9 亚型病毒。该病毒自  2013 年在我国家禽中出现后,持续流行于我国家  禽群体中。在 2016 年下半年至 2017 年上半年期间,  该病毒流行率上升显著,引起的人间病例数也骤然  增加,并且分化出高致病性 H7N9 亚型病毒。2017  年秋季,我国开始使用 H5 和 H7 二联双价疫苗对  各类家禽进行强制免疫,使得该病毒引起的家禽感  染率和人间病例数量迅速下降。本次调查未检出该  亚型病毒,也支持了疫苗免疫导致该亚型病毒流行  率显著下降之推断  。考虑到 2018 年上半年仅发  生 2 起 H7N9 家禽疫情,预计今后,该病毒将继续  维持较低的流行态势,但存在不确定性:既可能因  为疫苗免疫效果好、夏季病毒流行率低、野禽中病  毒储存数量有限等原因,导致该病毒被清除,也可能因为该病毒出现逃避疫苗免疫的变异株,或者出  现适应水禽的变异株,导致该病毒继续流行。  与往年调查一致,本次调查继续提示,我国  H9N2 亚型病毒分布广泛,在家禽中感染率高,尤其是活禽市场,这与既往调查结果相符 [6-9]  。鸡样 品的 H9N2 亚型阳性率最高,可能与该病毒发生更  适应于鸡的突变有关   。本次调查显示,江苏、江西、贵州、西藏的 H9N2 病毒样品阳性率较高,  说明这些省份 H9N2 亚型病毒流行较为严重,当然也可能与样品在宿主、场所等方面存在差异有关。

本次调查显示,2018 年的 H9N2 亚型病毒阳性率较往年显著升高,说明近年来 H9N2 亚型病毒的防控效果不佳,也可能是与样品在宿主、场所、采样时间等方面存在差异有关。

本次检出的 H9N2 病毒都属于 h9.4.2.5 分支,说明目前H9亚型病毒的流行分支还没有发生改变,基因特征仍表现为低致病性。

基于以上调查结果,建议继续加强活禽市场管理,大力推进活禽集中屠宰和冷鲜上市,继续使用 H5 和 H7 二联双价疫苗对各类家禽进行免疫,同时加强病原的流行病学调查监测。对于H9N2 亚型病毒,需要研究改进原有的防控策略,有效降低其流行率。


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