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2018年动物源细菌耐药性监测计划

日期:2018-02-06 10:29:09

农业部关于印发《2018年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

农医发(2018)5号

为贯彻落实《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017—2020年)》,进一步加强动物源细菌耐药性监测工作,促进养殖环节科学合理用药,保障动物源性食品安全和公共卫生安全,我部制定了《2018年动物源细菌耐药性监测计划》,现印发给你们,请遵照执行。


农业部

2018年1月31日


附件1

2018年动物源细菌耐药性监测任务承担单位及监测数量汇总表

检测单位

样品来源

养殖场要求

采样部位

细菌种类与数量要求

中国兽医药品监察所

安徽、广西

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠

沙门氏菌≥50株,弯曲杆菌≥50株

辽宁兽药饲料畜产品质量安全检测中心

辽宁、内蒙

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

上海兽药饲料检测所

上海、江苏

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

四川省兽药监察所

四川、云南

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

广东省农产品质量安全中心

广东、海南

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

中国动物卫生与流行病学中心

黑龙江、吉林

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌≥50株,金葡菌≥50株,弯曲杆菌≥50株

中国动物疫病预防控制中心

天津、青海

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株,弯曲杆菌≥50株

河南省兽药饲料监察所

河南、甘肃

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

湖南省兽药饲料监察所

湖南、贵州

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

陕西省兽药监测所

陕西、宁夏

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株,沙门氏菌或金葡菌≥50株

山东省农业科学院

山东、山西

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、鸭、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

沙门氏菌或金葡菌≥100株,弯曲杆菌≥100株

浙江省农业科学院

浙江、福建

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、鸭、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

沙门氏菌或金葡菌≥100株,弯曲杆菌≥100株

中国农业大学

至少包括北京和山西,其它不限

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为肉鸡和猪源样品。

动物肠道或拭子

魏氏梭菌≥200株

华南农业大学

至少包括所在地和邻近一个省份,其它不限

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为肉鸡和猪源样品。

动物肠道或拭子

魏氏梭菌≥200株

华中农业大学

至少包括湖北和邻近一个省份,其它不限

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为肉鸡和猪源样品。

动物肠道或拭子,鼻拭子

魏氏梭菌≥100株,副猪嗜血杆菌≥30株

西北农林科技大学

至少包括青海、宁夏,其它不限

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为羊源样品。

动物肠道或拭子、体表淋巴结

大肠杆菌≥100株,伪结核棒状杆菌≥100株,魏氏梭菌≥100株

北京市兽药监察所

北京

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株

江西省兽药饲料监察所

江西

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株

江苏省畜产品质量检验测试中心

江苏

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株

江苏省家禽科学研究所

江苏

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

弯曲杆菌≥100株

河北省兽药监察所

河北

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株

重庆市兽药监察所

重庆

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株

新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所

新疆

养殖场或屠宰厂共10-20个

屠宰厂为鸡、猪源样品。

泄殖腔拭子或动物盲肠,牛奶

大肠杆菌≥200株,肠球菌≥200株

注:采样时,大、中小型养殖场各半;主要采育成动物、鲜牛奶;分离大肠杆菌或肠球菌每个养殖场采样30~50份,分离其他细菌根据分离率来确定样品数量。屠宰厂采样时,应采集动物的直肠或盲肠样品。


附件2

2018年动物源细菌耐药性监测采样

和监测技术要点

一、采样安排

(一)采样地点选择

各监测任务承担单位按照《监测计划》进行选场、采样和分离细菌。同时,负责对本辖区内设立的全国定点监测场(见下表)长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药性变化趋势,每年采样2次,分上半年和下半年进行。

全国长期定点跟踪监测养殖场名录

地区

养殖场

上海

上海市崇明区慧岛养猪场、上海市崇明区瀛跃种禽场、上海市松江区太平洋家禽育种有限公司

辽宁

海城市世福种猪有限公司,锦州双八乳业宋家沟奶站

广东

江门盈康猪场,江门春茂畜牧有限公司(鸡场),广东陈召坤鸡场

四川

成都巨星农牧科技有限公司(猪场),遂宁市金绿农牧科技有限公司(猪场)、巨星崇州种鸡场(鸡)、四川新希望奶牛养殖有限公司

江西

江西南昌国泰养猪场,江西南昌明泰养鸡场(蛋鸡场)

湖南

湖南新五丰股份有限公司永安分公司、湖南湘佳牧业股份有限公司,宁乡广东温氏畜禽有限公司、湖南省金健乳第一牧场

山东

山东银宝养猪场,山东中慧养鸡场,益客养鸭场,维多利亚奶牛场

陕西

陕西省富平县海燕羊场,陕西省泾阳县晨辰奶牛养殖厂,陕西省西安市长安区东大南强养猪场,陕西省西安市长安区东大北强养鸡场

河南

河南益生源农牧发展有限公司(鸡),富源养殖专业有限公司(猪),洋江奶牛养殖专业合作社(牛)

北京

北京华都峪口禽业有限公司,北京顺鑫农业小店畜禽良种场

江苏

江苏常州市永康农牧猪场、江苏常州市红旗养鸡场、江苏常州市龙盛养鸡场

河北

石家庄旭晨养殖合作社(肉鸡),石家庄宝丰种鸡养殖场(蛋鸡),石家庄顺达养猪场(猪)

重庆

重庆鑫伟旭生态农业发展有限公司(鸡场),重庆市六九畜牧科技股份有限公司(猪场)

浙江

浙江宝仔农业发展有限公司(猪场)、浙江嘉兴三园鸡专业合作社(鸡场)、浙江绍兴董家竹山鸡场(鸡场)、杭州海青养殖有限公司(鸭场)、建德市三弟兄农业开发有限公司(鸡、鸭、猪屠宰场)

新疆

新疆天康种猪场,新疆阜康市泰昆养殖有限公司(鸡场),新疆呼图壁种牛场有限公司畜牧二场(牛)

天津

天津市精武种猪场(猪场),天津广源畜禽养殖有限公司第一分公司(蛋鸡),天津市武清区昭君肉鸡养殖专业合作社(肉鸡)

湖北

仙桃市神康生态牧业有限公司(猪),仙桃市天利养鸡专业合作社(鸡)

海南

海南传味文昌鸡产业股份有限公司(鸡场),海南丽康农业综合开发有限公司三江种猪场(猪场),海南艾森牧业有限公司(奶牛场)

安徽

嘉吉动物蛋白(安徽)有限公司,安徽禹王养殖有限公司

内蒙

新农村奶牛养殖合作社(牛),赤峰市农研院鸡猪服务部(鸡、猪)

黑龙江

齐齐哈尔市鑫兴养殖场(猪),齐齐哈尔市宏伟养殖场(肉鸡),

齐齐哈尔市新未来奶牛养殖场(牛)

云南

云南曲靖市龙源农牧科技发展有限公司(猪),昆明石林县骏杰养殖场(蛋鸡),昆明市石林县龙井山养鸡专业合作社(肉鸡)

福建

南阳实业有限公司(猪场)、周宁县生态林养殖专业合作社(鸡场)

山西

山西汾阳市荣璋猪业科技公司,山西张振国养殖场(鸡场),山西太原旺禅源牧业公司

青海

西宁市大通县录明养殖专业合作社(蛋鸡场),海东市乐都区达佑养殖有限公司(肉鸡场),海东市平安区金阳富硒良种猪有限公司(猪场)

宁夏

宁夏灵武市汇聚融农牧专业合作社、宁夏银川市贺兰县立岗养猪场(猪)、宁夏银川市贺兰县荣鑫蛋鸡养殖场(鸡)、宁夏灵武市华兴禽养殖有限公司

贵州

贵州都匀黔隆果菜基地开发有限公司、贵州息烽特驱家禽养殖有限公司、贵州都匀开发区天羽蛋鸡养殖场(鸡)

广西

南宁诚兴科技有限公司(蛋鸡),南宁隆安凤鸣农牧有限公司(肉鸡),广西雄桂种猪有限公司(猪)

吉林

同济牧业有限公司(猪)、龙潭万福养殖场(肉鸡)、

吉林春光牧工商集团公司(牛)

(二)采样类型

病死动物采集临床病料;健康动物采集泄殖腔或盲肠拭子作大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯曲杆菌分离;采集新鲜牛奶作金黄色葡萄球菌分离,根据养殖场规模,每个场采样30~50份。

(三)监测的细菌种类

包括大肠杆菌、肠球菌(分为屎肠球菌和粪肠球菌)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌(分为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌)等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地分离情况进行监测。

二、调查和记录

各监测任务承担单位要认真做好饲料和饲料药物添加剂来源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查(预防用药和治疗用药)和采集样品的统计,据实填写采样记录表。

三、细菌分离与鉴定

采用选择性培养基,定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌分离,用生化试验、PCR技术或血清学方法对分离物进行鉴定。本年度分离监测的细菌种类与数量要求见《监测计划》。分离到的菌株在-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或用其它合适方法自行保存,沙门氏菌和弯曲杆菌送中监所进行血清型鉴定后保存。

四、药物敏感性测定

用经中监所质量认定的药敏试验板进行药物敏感性检测,目前已进行质量认定的药敏板生产企业有:天津市金章科技发展有限公司和上海星百生物技术有限公司。检测用质控菌株由中监所统一供应。

 

附件3

采样记录表

采样地:                      养殖场:                          

采样时间:                     联系人姓名、电话:                   

样品来源

□猪       日龄 ____

□鸡       日龄 ____

□牛       日龄 ____

其他________日龄 ____

□消化道       □呼吸道   □泌尿生殖道

□肝胆         □脑       □淋巴结  

□关节         □奶样     □皮肤      

□粪便         其他______________   

采样动物健康状况                         养殖量                   

□健康    □发病及症状:                                           

                                                                     。

采样养殖场使用抗菌药情况

饲料来源、添加抗菌药种类

治疗用抗菌药种类与使用方式

生产厂名称

饲料添加的药物名称

剂量

使用时间

 

药物名称

使用方式

剂量    单个动物剂量

饮水添加剂量

        饲料添加剂量

用药天数

样品分离菌株

□大肠杆菌

□金黄色葡萄球菌

□肠球菌

□沙门氏菌

□空肠弯曲杆菌

其他__________________

菌株编号:

注:菌株编号按照“菌种、来源-采样地、采样年月-菌株编号”的格式进行。如EB-L0701-0001,其中:E(大肠杆菌)B(牛)L(鲁)07(年)01(月)-0001(菌株编号)。

菌种简写建议为:E(大肠杆菌)、S(沙门氏菌)、SA(金黄色葡萄球菌)、ECi(肠球菌)、CJ(空肠弯曲杆菌)、CC(结肠弯曲杆菌)

动物简写建议为:B(牛)、P(猪)、C(鸡)、D(鸭)




注:a为喂奶猪或保温鸡,b为保育猪或生长鸡,c为育成猪或鸡,d为种母猪或产蛋鸡。

附件4

动物源细菌分离和鉴定方法

 

一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定方法

1   范围

本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下。

2.1 冰箱:2℃~4℃和-20℃。

2.2 恒温培养箱:36℃±1℃。

2.3 电子天平:感量0.1g。

2.4 显微镜:10×~100×。

2.5 生物安全柜。

2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条。

2.7 采样管或商品化采样棉拭子。

2.8 微量加样器:1μL~1000μL。

2.9 吸头(与微量加样器匹配)。

3   培养基和试剂

3.1 运送培养基。

3.2 麦康凯琼脂。

3.3 大肠杆菌阳性血清。

4  大肠杆菌分离与鉴定程序


图1:大肠杆菌分离与鉴定程序

5  操作步骤

5.1 采样 

选择养殖场或屠宰场,灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品,置入运送培养基中,保存时间不超过48小时。

5.2 大肠杆菌的分离

5.2.1  拭子接种于麦康凯琼脂平板,36±1℃培养18~24h。

5.2.2挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落,麦康凯琼脂纯化一代。

5.2.3纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化,36±1℃培养16~18h,待进一步细菌鉴定。

5.3 大肠杆菌的鉴定

对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定。

必要时,采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。

 

二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定方法

1   范围

本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定。

2   设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下。

2.1 冰箱:2℃~4℃和-20℃。

2.2 恒温培养箱:36℃±1℃和42℃±1℃。

2.3 电子天平:感量0.1g。

2.4 显微镜:10×~100×。

2.5 生物安全柜。

2.6 恒温水浴锅:37℃~100℃。

2.7 PCR仪。

2.8 电泳仪。

2.9 电泳凝胶成像分析系统(或紫外透射仪)。

2.10 冷冻离心机。

2.11 采样管或商品化采样拭子。

2.12 小型离心管。

2.13 微量加样器:1μL~1000μL。

2.14 吸头(与微量加样器匹配)。

2.15 漩涡仪。

2.16 微波炉。

3   培养基和试剂

3.1 标准菌株:沙门氏菌CVCC 541。

3.2 DNA Maker。

3.3 Taq DNA 聚合酶。

3.4 dNTP。

3.5 琼脂糖。

3.6 5×TBE缓冲液。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)       54.0g

硼酸                         27.5g

0.5M EDTA(pH8.0)          20mL

加纯净水至                    1000mL

3.7  50×TAE buffer。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)           242g

NA2EDTA.2H2O                37.2g

醋酸                          57.1ml

加纯净水至                    1000mL

3.8  invA基因引物。

上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′

下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′

3.9 运送培养基。

3.11 沙门氏菌显色琼脂。

3.12 沙门氏菌阳性血清。

3.13 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)。

3.14 四硫磺酸盐增菌液(TTB)。

3.15 核酸染料。

3.16 氯化钠。

4   沙门氏菌分离与鉴定程序


图2 沙门氏菌的分离和鉴定程序

5  操作步骤

5.1 采样 

选择养殖场或屠宰场,用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔(肛门)样品,置入运送培养基中,保存时间不超过48小时。

5.2 沙门氏菌的分离

5.2.1  将拭子置于SC增菌液,36℃±1℃培养18~24h或TTB增菌液,42℃±1℃培养22~24h。

5.2.2将菌液混匀,接种沙门氏菌显色培养基,36℃±1℃培养22~24h。

5.2.3挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落,接种营养琼脂平板,36℃±1℃培养16~24h,待进一步细菌鉴定。

5.3 沙门氏菌的鉴定

5.3.1生化鉴定

对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定,或者通过5.3.2的方法进行分子生物学(PCR)鉴定。

必要时,用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。

5.3.2  PCR法鉴定

5.3.2.1  PCR模板的制备

用接种环从营养琼脂上挑选16~24h的纯培养物,置于0.5mL灭菌生理盐水中,12000r/min离心2min,弃上清。再加0.5mL灭菌水,悬浮并涡旋混匀,100℃沸水中煮沸10min后,移至冰上,冷却后以12000r/min离心2min,取上清液为PCR模板。

5.3.2.2  PCR反应体系的配制

   根据不同厂家PCR试剂用量,配制PCR反应体系,扩增片段长度约284 bp。

5.3.2.3  PCR反应条件

95℃预变性5min,94℃变性30s, 64℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环,最后72℃延伸10min,同时设立阴性和阳性对照。

5.3.2.4 电泳

5.3.2.4.1  1.2%琼脂糖凝胶板的制备

称取1.2g琼脂糖,加入100mL0.5×TBE(或1×TAE)缓冲液中,加入核酸染料,依据样品数选用适宜的梳子,琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子,取出胶块放入电泳槽中,加0.5×TBE(或1×TAE)缓冲液淹没胶面。

5.3.2.4.2 加样

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔,每次电泳时,各做一个阳性对照和阴性对照。

5.3.2.4.3 电泳条件

电压110V,电泳时间30min。

5.3.2.5 结果判定

电泳结束后,取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。

如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上,即条带与加样孔的距离相同,而阴性对照无此条带,则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌,必要时可通过测序来进一步确证。

 

三、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定方法

 

1  范围

本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。

本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1  冰箱:0℃~4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱:36℃±1℃和42℃。

2.3  显微镜:10×~100×。

2.4  商品化或自制采样管。

2.5  无菌离心管。

2.6  离心机。

2.8  商品化拭条或微生物鉴定仪。

3   培养基和试剂

3.1  标准菌株:金黄色葡萄球菌ATCC29213。

3.2  显色培养基。

3.3  7.5%氯化钠肉汤10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤。

3.4  营养肉汤或BHI肉汤。

3.5  营养琼脂。

3.6  新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆。

3.7  0.3%过氧化氢液。

3.8  0.85%无菌生理盐水。

4  金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序

图3 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序

5   操作步骤

5.1  采样

5.1.1牛奶样品:到已选定的奶牛养殖场,现场采牛奶置入灭菌试管中,0℃~4℃保存,不超过48h。

5.1.2扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子:无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子,上呼吸道拭子置入灭菌试管中,0℃~4℃保存不超过48h。

5.1.3  吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中,振荡混匀。

5.2    增菌和分离培养

5.2.1  将上述样品匀液于36℃±1℃培养18~24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

5.2.2  将上述培养物,分别划线接种到显色培养基平板上,无菌操作将发病动物组织直接划线, 36℃±1℃培养24~48h。

5.2.3  挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代,待进一步细菌鉴定。

5.3  金黄色葡萄球菌的鉴定

5.3.1生化鉴定  将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌,首先进行触酶试验,应为阳性。

将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落,悬浮于5mL灭菌生理盐水,按照生化鉴定试条使用说明书操作, 37℃培养18~24h后判读结果。

5.3.2血浆凝固酶试验法   挑取显色平板上可疑菌落1个或以上,分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板,36℃±1℃培养18~24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌,首先进行触酶试验,应为阳性。

    新鲜兔血浆制备:称取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100mL,溶解后过滤,装瓶,121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血四份,混好静置 (或以3000r/min 离心30 min),使血液细胞下降,即可得血浆。

取新鲜配置兔血浆0.5 mL,放入小试管中,再加入BHI 培养物0.2~0.3 mL,振荡摇匀,置36℃±1℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6 h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。

 

四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定方法

 

1   范围

本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。

本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。

2   设备和材料

除微生物实验室常规灭菌与培养设备外,其他设备和材料如下。

2.1  采样管。

2.2 采样棉拭子。

2.3 生物安全柜。

2.4 恒温培养箱: 25℃±1℃,36℃±1℃,42℃±1℃。

2.5 恒温水浴锅:37℃~100℃。

2.6 微需氧条件:5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气,或商品化微需氧包。

2.7 显微镜:10×~100×。

2.8 微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条   。

2.9 高速冷冻离心机:≥12000r/min。

2.10 小型离心管:1.5mL。

2.11 微量加样器:1μL~1000μL。

2.12 吸头(与微量加样器相匹配)。

2.13 PCR仪。

2.14 微波炉。

2.15 电泳仪。

2.16 电泳凝胶成像分析系统(或紫外透射仪)。

3  培养基和试剂

3.1 质控菌株:空肠弯曲杆菌标准菌株(ATCC 33560)。

3.2 DNA  Marker 。

3.3  引物及扩增片段长度。

3.3.1  引物

空肠弯曲菌:上游 5’CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT    3’,下游 5’AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC  3’,扩增片段长度为 773bp。

结肠弯曲杆菌:上游:AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC,下游:TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC,扩增片段长度为364bp。

3.4 运送培养基。

3.5 弯曲菌选择性(CCD)培养基。

3.6 哥伦比亚血琼脂培养基。

3.7 生理盐水。

3.8 10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ。

3.9 氯化镁溶液(25mM)。

3.10 Taq 聚合酶(0.5U/μL)。

3.11 dNTPs(2mM)。

3.12 琼脂糖。

3.13 50×TAE缓冲液:将242gTris碱,57.1mL冰乙酸,100mL0.5M  EDTA(pH8.0),加纯水至1000mL。

1×TAE缓冲液: 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份,混匀即可。

3.14 上样缓冲液。

3.15 溴化乙锭溶液(10mg/mL):称取1g溴化乙锭溶于100mL水中,用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解,避光冷藏(4℃)保存。

3.16 矿物油。

4  空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序


图4  弯曲杆菌的分离和鉴定程序

5   操作步骤

5.1 分离与纯化

5.1.1分离

将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹,用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。

5.1.2培养

将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中,在微需氧条件下培养24h~48h。

5.1.3纯化

观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落,按3.2的培养条件培养纯化。

5.2 鉴定

5.2.1生化鉴定

对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定,并进行结果判定。或者通过5.1~5.4的试验进行分子生物学(PCR)鉴定。

5.2.2  分子生物学(PCR)鉴定

用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5mL生理盐水的小型离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。再加0.5mL灭菌水,悬浮并涡旋混匀,100℃沸水中煮沸10min后,取出置于冰浴中冷却5min后,12000r/min(4℃)离心2min,取上清作为PCR模板。

5.2.2.1 PCR反应体系

根据不同厂家PCR试剂用量,配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。

5.2.2.2 PCR反应条件

采用的PCR反应条件见下表。

PCR反应程序表

5min, 94℃

1min,94℃,1min,64℃,1min,72℃,2*

1min,94℃,1min,62℃,1min,72℃,2*

1min,94℃,1min,60℃,1min,72℃,2*

1min,94℃,1min,58℃,1min,72℃,2*

1min,94℃,1min,56℃,1min,72℃,2*

1min,94℃,1min,54℃,1min,72℃,30*

10min,72℃

5.2.2.3 电泳

5.2.2.3.1 1.0%琼脂糖凝胶板的制备

称取1.0g琼脂糖,加入100mL0.5×TBE缓冲液(或1×TAE缓冲液)中。加热融化后加5μL(10mg/mL)溴化乙锭,混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放入电泳槽中,加0.5×TBE缓冲液(或1×TAE缓冲液)淹没胶面。

5.2.2.3.2 加样

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物各1孔作为对照。

5.2.2.3.3 电泳条件

电压110V,电泳时间40min。

5.2.2.4 结果判定

电泳结束后,取出凝胶板置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。

如果某一待检样品扩增产物的条带与空肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上,即它们与加样孔的距离相同,则该样品分离到的菌株可判定为空肠弯曲杆菌;如果与结肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上,即它们与加样孔的距离相同,则该样品分离到的菌株可判定为结肠弯曲杆菌;

必要时,可以通过测序来进一步确证。

 

五、动物源屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定方法

 

1   范围

本方法规定了用于屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下。

2.1 冰箱:2℃~4℃和-20℃。

2.2 恒温培养箱:36℃±1℃。

2.3 电子天平:感量0.1g。

2.4 显微镜:10×~100×。

2.5 生物安全柜。

2.6 生化鉴定卡或商品化试条。

2.7 采样管或商品化采样棉拭子。

2.8 微量加样器:1μL~1000μL。

2.9 吸头(与微量加样器匹配)。

3   培养基和试剂

3.1 运送培养基。

3.2 肠球菌显色培养基。

4   屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序


图5:屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序

5  操作步骤

5.1 采样 

选择养殖场或屠宰场,灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品,置入运送培养基中,保存时间不超过48小时。

5.2 屎肠球菌和粪肠球菌的分离

5.2.1  拭子接种于肠球菌显色琼脂平板,36℃±1℃培养18~24h;

5.2.2挑取红色至紫红色的可疑菌落,显色琼脂上纯化一代,

5.2.3纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化,36℃±1℃培养16~18h,待进一步细菌鉴定。

5.3 屎肠球菌和粪肠球菌的鉴定

对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定、判定结果。

必要时,采用肠球菌标准血清进行血清型鉴定。

 

六、魏氏梭菌的分离与鉴定方法

 

参照相关国际标准。

 

七、副猪嗜血杆菌的分离与鉴定方法

参照相关国际标准。

 

八、伪结核棒状杆菌的分离和鉴定

参照相关国际标准。

 

附件5 

药敏试验检测试剂盒

使用(MIC测定)操作方法

1   范围

本方法规定了动物源细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌)药敏检测试剂盒的操作方法。

2   材料

除微生物实验室常规灭菌设备外,其他设备和材料如下:

2.1 恒温培养箱35±2℃。

2.2 生物安全柜。

2.3 浊度计或者标准比浊管。

2.3 微量加样器1uL~1000uL。

2.4 吸头(与微量加样器匹配)。

3   操作步骤

3.1 取出试剂盒,打开包装待用。

3.2 菌液制备

将无菌棉签用生理盐水润湿后,直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落,与适量无菌生理盐水混匀。然后,用标准比浊管或者浊度计校正菌液浓度至0.5麦氏单位(1~2×108CFU/mL)。最后,用试剂盒中的肉汤100倍稀释,混匀备用。

3.3 菌液接种

除空白对照外,其余的95孔加入制备好(用前要混匀)的菌液100µL

空白对照孔中加入100µL无菌肉汤。盖好板盖并记录菌号。

3.4 孵育

将检测板置于35℃±2℃很稳培养箱中孵育16~18小时。

3.5 观察结果

在衬有黑底板的光线下,用肉眼观察。

先观察阴性对照孔和阳性对照孔:阴性对照孔应无细菌生长,孔内液体未见浑浊;阳性对照孔内应有细菌生长所形成的圆形或者网状沉淀。

如果阴性和阳性对照结果正常,继续观察其余孔内细菌生长情况,在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。

4   结果记录

将MIC结果记录在耐药性检测结果统计表(附件6)中。

备注:(1)目前国内经过质量认证的药敏检测试剂盒市场厂家为:上海星佰生物技术有限公司、天津金章科技发展有限公司和英国先德(Sensititre)有限公司。

(2)如试剂盒使用方法与本方法有差别,请按照试剂盒方法操作。

附件6

敏感性检测结果统计表

一、G-菌(包括大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌)MIC

  养殖场:                              检测员:               年   月   日

菌株

编号

西

阿莫西林/克拉维酸

头孢他啶

四环素

磺胺异噁唑

复方新

美罗


AM

A/C

CTD

CFT

GM

SPT

TE

FFC

SF

SXT

ENR

OFX

IPM

MEQ

AP

COL






















































































注:直接填写检测的MIC数值。

 

二、G+菌(包括肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌)MIC

 养殖场:                              检测员:            年   月   日 

号     

青霉素

阿莫西林/克拉维酸

西

苯唑西林

庆大霉素

多西环素

磺胺异噁唑

复方新

氟苯尼考

克林霉素

替米考星

利奈唑胺


P

A/C

CFT

CX

OXA

GEN

DOX

ENR

OFL

SF

SXT

FFC

ERY

CLI

TIL

TM

LNZ

VA
































































































注:直接填写检测的MIC数值。

 

三、弯曲杆菌MIC

养殖场:                           检测员:                年   月   日 

菌株

编号


GEN

TET

NAL

CIP

FFC

ERY

CLI

AZI

TEL









































注:直接填写检测的MIC数值。

 

四、肠球菌和魏氏梭菌MIC(促生长抗菌药物监测)

养殖场:                     检测员:            年   月   日 

菌株

编号

阿维拉

霉素

维吉尼亚霉素

吉他

霉素

西

恩拉

霉素


AVL

VGA

TET

KTM

BCT

NOS

FLV

ERA

QCT










































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